SEGUNDA PONENCIA:
UTILIDAD PRACTICA DE LOS MARCADORES DE LA INFLAMACION EN LAS ENFERMEDADES ALERGICAS

MODERADOR:
Dr. Luis Prieto.
Jefe de la Sección de Alergia del Hospital "Dr. Presset". Valencia.

LOS PRODUCTOS DERIVADOS DE LA ACTIVACION DE LOS EOSINOFILOS Y SUS IMPLICACIONES PATOLOGICAS

Autora: María Luisa Sanz.
Facultad de Medicina. Universidad de Navarra. Clínica Universitaria. Pamploma.

El eosniófilo fue considerado durante muchos años como una célula protectora en la defensa frente a parásitos, así como un amortiguador de la actividad de los mastocitos mediante la liberación de factores inhibidores de mediadores mastocitarios tales como la histaminasa, arilsulfatasa, leucotrienos, fosfolipasas, etc.
Desde hace unos 15 años, el descubrimiento de los receptores de membrana del eosinófilo para la IgE y para otras moléculas, el estudio de las proteínas granulares, así como su capacidad para generar citoquinas y mediadores pro-inflamatorios, apuntan hacia papeles más relevantes en la fisiopatología que acompaña al proceso inflamatorio, que se pone en marcha tras una reacción alérgica.
Repasando brevemente los receptores y moléculas que expresa un eosinófilo podemos presumir ya su implicación en estos tipos de reacciones. Esta célula expresa receptores de baja afinidad para la IgG FcgRII (CD32), para la IgA y para el componente secretor de la misma, receptores de alta y de baja afinidad para la IgE FceRI y FceRII (CD23). Por otra parte posee receptores Mac-2, que es una lectina perteneciente a la familia de la S-lectina. Así mismo posee receptores para componentes del complemento (C1, C3, C4, C5), para las citoquinas IL3, IL5, GM-CSF y para mediadores lipídicos PAF y LTB4. Por otra parte expresan b2-integrinas LFA-1, Mac-1 y p150, 95, VLA-4 (ligando para VCAM-1 de las superficies endoteliales activadas).
El eosinófilo expresa también la glicoproteína CD4, lo que le hace susceptible a ser infectado por el virus de la inmunodeficiencia humana. En su estado inmaduro expresa proteínas de la clase II del sistema mayor de histocompatibilidad y la forma madura tras estímulo con GM-CSF, lo que la convierte en una posible célula presentadora de antígeno.

MECANISMOS INMUNOLOGICOS QUE PARTICIPAN EN UNA REACCION ALERGICA MEDIADA POR IgE

Entre las células más importantes que participan en una reacción alérgica mediada por IgE recordemos que no sólo los mastocitos son importantes en la iniciación y mantenimiento de la respuesta alérgica. Aunque los otros tipos celulares implicados en la inflamación alérgica son potenciales fuentes de citoquinas, las células T CD4+ son únicas en el sentido de que pueden reconocer y responder a antígenos procesados directamente, y se piensa que juegan un papel importante en la iniciación y la orquestación del proceso inflamatorio del asma, especialmente en aquellas situaciones donde la respuesta IgE mediada no existe o es mínima. Se sabe que los linfocitos T producen IL-3, IL-5 y GM-CSF, agentes implicados en la maduración, supervivencia, activación y acumulación local de los eosinófilos y mastocitos (IL-3).
Los pacientes con asma agudo severo tienen niveles elevados de linfocitos T activados (CD25+/CD4+) circulantes en sangre periférica, que disminuyen de forma progresiva tras tratamiento corticoideo. Los linfocitos T de pacientes con asma resistente a los corticoides expresan esos marcadores de activación in vivo y son refractarios a los efectos inhibidores de los corticoides in vitro.
Por otra parte los linfocitos cultivados de sangre periférica de pacientes asmáticos, tanto extrínsecos como intrínsecos, secretan GM-CSF, IL-3 e IL-5 de forma espontánea que prolongan la supervivencia de los eosinófilos in vitro, de modo que se correlaciona con el número de eosinófilos periféricos en los mismos sujetos.
En personas con asma leve, el número de linfocitos T CD4+ activados en BAL se correlaciona con la actividad de la enfermedad. También se ha observado una disminución de linfocitos CD4+ en sangre periférica e incremento selectivo de linfocitos T CD4+ en BAL a las 48 horas de la provocación bronquial antígeno-específica, lo que sugiere que un incremento específico de este tipo de células ocurre en este modelo experimental de asma.
Estudios sobre biopsias de mucosa bronquial demuestran que existen niveles significativamente elevados de linfocitos T (CD25+) en pacientes asmáticos, comparado con los controles. Utilizando técnicas de hibridación in situ, se ha demostrado que existe mRNA para IL-5 en las células de la mucosa bronquial en la mayoría de asmáticos leves y no en controles sanos. El número de señales mRNA se correlaciona de forma ligera con el número de linfocitos T activados y con los eosinófilos de biopsias de los mismos pacientes. Los linfocitos T de BAL de pacientes con asma extrínseco leve muestran expresión de mRNA para IL-4 e IL-5, lo que refleja un patrón tipo TH2. Tras tratamiento corticoideo hay una reducción significativa expresión de mRNA para las citoquinas tipo TH2 (IL-4 e IL-5), así como un aumento, discreto pero significativo, en la expresión de mRNA para IFN-g en muestras obtenidas tras biopsia.
El descubrimiento en el hombre de las clonas de linfocitos T CD4+ TH1 o TH2, con su selectiva liberación de citoquinas nos ha ayudado a conocer mejor dichos mecanismos. En este sentido como es sabido el individuo alérgico manifiesta una activación preferente TH2 con la producción de IL4, IL5, IL3, GM-CSF, que entre otras acciones son capaces de promover la producción de IgE y la activación y desarrollo de células tales como basófilo, mastocito y eosinófilo. Este último concretamente es promovido a diferenciarse por tres citoquinas: CM-CSF, IL3, IL5, siendo esta última más específica, aunque no exclusiva para el eosinófilo.
Por otro lado, el subtipo TH1 parece más íntimamente relacionado con la clásica reacción de hipersensibilidad de tipo retardado y la respuesta de hipersensibilidad celular, a través de la generación de IL-2, TNF-b e IFN-g. Parece existir una relación recíproca entre TH1 y TH2, dado que la IL-10 producida por los TH2 inhibe la proliferación de TH1 y el IFN-g procedente de los TH1 inhibe la proliferación de los TH2.
Un dato adicional importante es el requerimiento obligatorio de IL-4 de las células TH2 para su diferenciación inicial y supervivencia.

FASE TARDIA DE LA REACCION ALERGICA INMEDIATA EN EL ASMA BRONQUIAL

El estudio de la fase tardía de la reacción inmediata, que tiene lugar en el curso de algunas reacciones alérgicas mediadas por IgE ha llevado a la identificación de mecanismos inmunológicos que perpetúan o cronifican dichas reacciones. Entre ellos citaremos la activación T, la producción de citoquinas y el reclutamiento de células tales como mastocitos y eosinófilos al foco de la reacción, como ya hemos citado anteriormente.
Aunque es un hecho evidente la participación de muchos tipos celulares en el asma cuando se cronifica, el dato más característico de la lesión histopatológica es la intensa infiltración de la mucosa por eosinófilos y células mononucleares.
En el asma episódico la activación del mastocito tras la unión del Ag bivalente a la IgE de membrana, provoca la liberación de mediadores tales como la histamina, prostaglandinas, PAF, leucotrienos, etc., responsables entre otras acciones de la producción de broncoespasmo.
En la fase tardía de la reacción alérgica y en el asma crónico se implican otros tipos celulares como los comentados más arriba, de tal forma que la reacción alérgica o mejor dicho inflamatoria se perpetúa, debido a la liberación de citoquinas tipo TH2, lo cual junto con los autacoides generados por el mastocito atraería células al medio tales como el eosinófilo, los cuales tras la liberación de los productos contenidos en sus gránulos contribuirían a efectuar el daño tisular.
Tomados en conjunto, estos datos soportan la hipótesis general de que, tanto en el asma intrínseco como el extrínseco, los linfocitos T CD4+ secretan linfoquinas que son relevantes para la acumulación y la activación de los eosinófilos en la mucosa bronquial, si bien, la identificación precisa de las células origen de estas citoquinas permanece aún sin realizar y constituirá un importante avance en el entendimiento de estos procesos.

MECANISMOS INMUNOLOGICOS IMPLICADOS EN LA DERMATITIS ATOPICA

Mientras que los mecanismos inmunológicos implicados en el asma bronquial son relativamente conocidos, la provocación y mantenimiento de la lesión eczematosa que acompaña a la dermatitis atópica es un motivo de controversia. Un hecho aceptado es la participación de las células de Langerhans portadoras de receptores de baja afinidad para la IgE, como células presentadoras de Ag. Por otra parte y al igual que ocurre en el asma bronquial la activación TH2 llevaría al reclutamiento y activación de células tales como el mastocito y el eosinófilo. Los productos procedentes del eosinófilo tales como la Proteína Básica Mayor (MBP) y la Proteína catiónica del eosinófilo (ECP) parecen estar elevadas en pacientes afectos de eczema atópico severo.

MECANISMOS DE ACTIVACION DEL EOSINOFILO

El eosinófilo es una célula que se caracteriza por presentar un núcleo bilobulado y numerosos gránulos citoplasmáticos que pueden dividirse en secundarios o específicos e inespecíficos.
Los granulos secundarios son afines a colorantes ácidos como la eosina, su tamaño es de 0,5-1 m5. Ultraestructuralmente están formados por uno o varios núcleos electrodensos denominados core, el cual contiene la MBP y una matriz homogénea radiotrasparente, que contiene ECP, EDN/EDX y EPO.
En cuanto a los agentes que son capaces de activar al eosinófilo podemos enumerar a los siguientes: IL5, GM-CSF, TNFa, PAF, C3b, IgG, IgE, IgA. Estos agentes permiten el paso de eosinófilo en reposo EG1+ a la formación activada, detectada por el monoclonal EG2, que reconoce la proteína X y la proteína catiónica del eosinófilo.
Cuando esta activación tiene lugar se produce la iberación de las proteínas granulares del eosinófilo: Proteína Básica Mayor (MBP) y la Proteína catiónica del eosinófilo (ECP) Peroxidasa del eosinófilo (EPO).
En cuanto a las actividades atribuidas a las proteínas granulares del eosinófilo destacan las citotóxicas, helmintóxicas y neurotóxicas, en líneas generales y que cuando afectan al árbol respiratorio se traducen en un daño epitelial con hiperreactividad bronquial, broncoespasmo y activación de otros elementos celulares tales como el mastocito.
Existe una liberación diferencial del contenido granular del eosinófilo, de forma que cuando el estímulo es IgE mediado se libera EPO, cuando es IgG mediado se libera ECP y si la activación es mediada por IgA se libera EPO, ECP y EDN.
Una vez activado el eosinófilo produce una serie de citoquinas tales como TGFA, TGFb, GM-CSF, IL1, IL3, IL5, IL6, IL8, MIP-1a y TNFa.
Por otra parte se comportan como agentes quimiotáctivos del eosinófilo algunos lípidos tales como PAF, LTB4; agentes de bajo peso molecular como C5a y f-MLP, ECF-a y citoquinas tales como IL5, IL3, GM-CSF, RANTES o IL8.

PROTEINA CATIONICA DEL EOSINOFILO

Caracterizada por Olsson, es una proteína altamente catiónica que constituye el 30% del contenido proteico granular. El contenido de ECP (Eosinophil Cationic Protein) de los eosinófilos en un individuo sano es aproximadamente 26, 5g/10⁶ células.
También es sintetizada como una pre-proteína que posteriormente es procesada para formar la forma de almacenamiento en el gránulo. La cadena de aminoácidos N terminal es muy similar a la de la EDN, así como muy parecida a la de la ribonucleasa pancreática. El cromosoma donde se localizan los genes que codifican tanto la ECP como la EDN es el 14q.
Se han desarrollado técnicas para determinar ECP en fluidos. Los niveles séricos determinados en poblaciones sanas, determinados por estos métodos son 31 5g/ml y 6 5g/ml respectivamente. La tasa de eliminación sérica in vivo, t1/2, es de 65 minutos. Recientemente ha sido ideado un enzimoinmunoensayo que parece más rápido y sensible que los métodos anteriores.
Han sido descritas dos formas antigénicamente distintas de ECP que son reconocidas por anticuerpos monoclonales diferentes llamados EG1 y EG2. La segunda parece reconocer la forma secretada de la ECP y de la EDN, por lo que ha sido considerada como un marcador de la activación del eosinófilo. Utilizando este marcador se puede determinar la presencia de eosinófilos en preparaciones histológicas donde tienen apariencia de formaciones granulares.
El mecanismo de la acción de la ECP es una citotoxicidad secundaria a la formación de canales transmembrana, de forma similar a la que se produce en las interacciones entre la membrana y el complemento.
En cuanto a sus funciones, al igual que la EDN, tiene alta actividad bactericida, actividad helmintotóxica mayor que la MBP, actividad neurotóxica mayor que la EDN y actividad ribonucleasa. Tiene propiedades citotóxicas que son superiores a las de la MBP y a las de la EDN, y se ha demostrado su capacidad de dañar el epitelio respiratorio.
Otras propiedades no citotóxicas son las alteraciones en la producción de glucosaminoglicanos en los fibroblastos humanos y la estimulación de la secreción de moco en la vía aérea, lo que habla en favor del papel el eosinófilo en la regulación del proceso reparador de la vía aérea en el asma bronquial.
La ECP estimula la liberción de histamina por los mastocitos. Tiene la capacidad de regular la actividad del complemento in vivo e interfiere con el proceso de coagulación, dado que incrementa la formación de Calicreína, interacciona con los factores de coagulación, incrementa la formación del coágulo dependiente del Factor XII y se le supone responsable de las anormalidades de coagulación frecuentemente encontradas en pacientes con hipereosinofilia idiopática.
Los mecanismos de regulación de la ECP in vivo se realizan a través de la unión con la heparina y con la a-2-macroglobulina.

PEROXIDASA DEL EOSINOFILO

Es otra proteína catiónica exclusiva del eosinófilo, con una concentración aproximada de 15, 5g/10⁶ eosinófilos. Parece que también proviene de un precursor que posteriormente es fragmentado. La secuencia de nucleótidos de la EPO (Eosinophil Peroxidase) es muy similar al de otras proteasas, lo que sugiere que existen una familia de multigenes de nucleasa que ha evolucionado por duplicación génica. Estudios preliminares sugieren que el gen de la EPO se encuentra en el cromosoma 17, cerca del de la MPO, lo que apoyaría más esta última hipótesis.
La EPO es capaz de oxidar, en presencia de peróxido de hidrógeno (H₂O₂), haloides para producir ácidos hipohalosos muy reactivos, utilizando preferentemente bromuro en vez de cloruro, al contrario que otras peroxidasas del sistema mononuclear fagocigótico. Estos compuestos hipohalosos ejercen efecto tóxico sobre las células y elementos extracelulares por distintos mecanismos: Halogenación por unión covalente a estructuras celulares y oxidación de grupos químicos fundamentales.
Tiene propiedades tóxicas para una gran cantidad de microorganismos como Escherichia coli, Esquistomas, Microfilarias, Trypanosoma, Toxoplasma y Micobacterias 91, 144, 178, y se une a S aureus, T crucy y Toxoplasma gondii lo que potencia la eliminación de estas células por los fagocitos mononucleares. También tiene propiedades tóxicas sobre mastocitos, células tumorales y células de mamíferos como el epitelio respiratorio, con o sin la participación de H₂O₂, aunque parece ser más tóxica con su presencia. La instilación intratraqueal en primates provoca broncoconstricción transitoria.
La EPO induce la degranulación y liberación de histamina por los mastocitos de rata de forma específica. También produce un descenso en el número de b-receptores en la membrana pulmonar de cobayas.
La EPO podría estimular la función antitumoral de los macrófagos de forma independiente a la actividad catalítica de la misma, estimulando la liberación de TNF y otros mediadores por parte del macrófago. Es un potente quimiotáctico y estimulador de la liberación de los gránulos de las plaquetas y podría regular la inflamación mediante interacción con Leucotrienos, reduciendo su actividad, y también mediante la modulación del complemento.
Al igual que la MBP, la EPO parece que pueden tener una función antagonista de los receptores muscarínicos M2 de vías aéreas, lo que podría dar lugar a un disbalance de la función simpático-parasimpático, con la consecuente broncoconstricción.

NEUROTOXINA DEL EOSINOFILO

Aislada y caracterizada por Peterson, es idéntica a la EPX (Eosinphil Protein X). El contenido se ha estimado en 10 5g/10⁶ eosinófilos, aproximadamente el 12% del contenido granular del eosinófilo. Está codificada en el mismo gen que la ECP, el 14q, y tiene una gran similitud de bases con ésta, lo que habla de un origen común de ambas proteínas.
Tiene un efecto muy similar a los de la ECP, aunque tiene un mayor poder ribonucleasa, menor poder citotóxico y neurotóxico, y un poder helmintotóxico relativamente bajo.
Inoculada intratecalmente en cobayas y conejos produce neurotoxocidad que se manifiesta en forma de rigidez, ataxia, incoordinación seguido de debilidad y atrofia muscular severa (fenómeno de Gordon). Los pacientes con síndrome hipereosinofílico idiopático y los pacientes con eosinofilia en el líquido cefalorraquídeo de cualquier etiología presentan diversas alteraciones neurológicas, que podrían estar relacionadas con estas proteínas granulares.
En sangre periférica de pacientes asmáticos, las concentraciones de EDN están elevadas, se incrementan en la respuesta tardía tras provocación bronquial antígeno-específica.
Todo lo expuesto nos hace contemplar al eosinófilo como un importante modulador de la respuesta inflamatoria, capaz de ejercer funciones pro y anti-inflamatorias y con un efecto tanto autocrino como paracrino.

PROTEINAS GRANULARES DEL EOSINOFILO COMO MARCADORES DE INFLAMACION

Desde hace algunos años, existe la posibilidad de cuantificar de las proteínas granulares del eosinófilo en distintos fluidos corporales. Entre dichas proteínas la ECP es la de uso más extendido. Ha podido comprobarse la elevación de esta proteína en diversos procesos patológicos tanto alérgicos (asma bronquial, rinoconjuntivitis alérgica, dermatitis atópica), como en otras patologías tales como la artritis reumatoide, enfermedades inflamatorias del tubo digestivo, meningitis bacteriana, pénfigo, etc.
Los datos existentes en la literatura avalan la utilidad de la determinación de esta proteína como marcador de severidad de la enfermedad, así como en la monitorización del tratamiento corticoideo.

ECP Y DERMATITIS

Hay estudios que demuestran la elevación de la ECP en pacientes afectos de dermatitis atópica y con una clara correlación con la severidad clínica de la enfermedad. Por otra parte se ha podido comprobar la presencia de eosinófilos activados en la piel, mediante su marcaje con el anticuerpo monoclonal EG2, que reconoce la proteína X del eosinófilo (EPX/EDN) y la ECP, de manera que se puede hacer un contaje diferencial de los eosinófilos no activados, marcados con EG1.
El síndrome de Wells, una dermatitis granulomatosa recurrente que cursa con eosinofilia y que según la experiencia de algunos autores y de la nuestra propia, presenta un aumento de la ECP sérica coincidiendo con los períodos de brote o recidivas de la enfermedad, cifras que disminuyen tras el tratamiento corticoideo. La determinación de ECP en el exudado procedente de las ampollas resultó ser mayor de 200 ng/ml, en nuestro paciente.

PROTEINAS GRANULARES DEL EOSINOFILIO EN EL ASMA BRONQUIAL

Por otra parte y tratando de valorar el comportamiento de estas proteínas (ECP, EPO) en el asma bronquial estudiamos un grupo de 123 asmáticos en comparación con 31 controles sanos. Dichos pacientes fueron clasificados como portadores de asma leve, moderado o severo, de carácter intrínseco o extrínseco. Así mismo se les aplicó un score de asma que valora paralelamente la sintomatología clínica, el tratamiento y las pruebas de función respiratoria.
En primer lugar observamos como la cifra media de ECP detectada en los controles es de 13,22 ± 1,11 ng/ml, siendo la diferencia con el grupo de asmáticos altamente significativa (p < 0,001). Así mismo los eosinófilos se encuentran elevados en la población de asmáticos. La EPO se encuentra también elevada en el grupo de pacientes.
Al valorar los grupos según la severidad del asma, observamos como la ECP se encuentra más elevada en los grupos más severos, lo mismo que la EPO y las cifras de eosinófilos, lo que demuestra que la detección de estas proteínas es un reflejo de los niveles de inflamación, así como de un mayor grado de liberabilidad de las proteínas granulares presente en estos enfermos.
Por otra parte al valorar la actividad clínica de la enfermedad vemos como la ECP se encuentra elevada en el grupo de pacientes con enfermedad en fase activa, con respecto a los que presentaban asma silente en el momento del estudio. La EPO se comporta de la misma manera.
No encontramos diferencias dependientes del tipo de asma que presentaban los pacientes (intrínseco o extrínseco), ni para la ECP, ni para la EPO.
No encontramos correlación entre la cifra de ECP sérica y los distintos parámetros de sensibilización atópica, como son la cifra de IgE total, la cifra de IgE específica, el tamaño de la pápula, y el porcentaje de liberación de histamina.
Encontramos una correlación positiva y significativa entre ECP y EPO (r = 0,77, p< 0,001), así como entre dichas proteínas y cifras de eosinófilos. También observamos la existencia de una correlación inversa significativa entre niveles séricos de proteínas granulares y parámetros de pruebas de función respiratoria, lo cual demuestra que pueden considerarse como marcadores de activación y extensión del proceso inflamatorio.
También existe una correlación positiva y significativa entre ECP, EPO y el score global aplicado (r = 0,52, p < 0,001) (r = 0,46, p < 0,001).

PRODUCCION DE ECP IN VITRO

Dado que la liberación de proteínas granulares parece ser la consecuencia del estímulo antigénico, en una segunda parte de nuestro estudio, valoramos el comportamiento in vitro de eosinófilos procedentes de pacientes alérgicos a Dermatophagoides pteronyssinus, tras aplicar distintos estímulos inmunológicos tanto específicos (Ag), como inespecíficos (IL5, anti-IgG, anti-IgE) y comprobamos si en contacto con otros tipos celulares tales como basófilos, linfocitos, etc., existe una liberación diferencial de esta proteína. Paralelamente evaluamos la cinética de liberación, valorando la producción de ECP a los 30 minutos y a las 6 horas de estímulo.
En cuanto a los resultados obtenidos en esta fase del estudio, pudimos comprobar una mayor producción de ECP a las 6 horas de la incubación tanto en los controles como en los enfermos, atribuible a una mayor liberabilidad basal y total del contenido granular en el curso del tiempo.
Sorprendentemiente no encontramos diferencias dependientes de la dosis de Ag, o de las concentraciones de IL5, entre controles y pacientes.
A los 30 minutos del estímulo el comportamiento es similar entre los controles y los enfermos. Sin embargo a las 6 horas se observa una mayor liberación por parte de los pacientes y dependiente de la concentración de IL5. Observamos que si bien el efecto de la concentración del Ag no fue significativo, en el caso de los pacientes, las mayores liberaciones se produjeron con las dosis más altas de D. pteronyssinus (20 ng/ml).
El estímulo con anti-IgG fue máximo también a las 6 horas y en el grupo de pacientes.
Cuando estimulamos con anti-IgE observamos una mayor liberación en los cultivos celulares procedentes de los pacientes de basófilos, sería el responsable indirecto de esta liberación, debido a la liberación de sustancias quimiotácticas para el eosinófilo tales como ECF-A y LTB4, así como la liberación de citoquinas TH2 tras la activación del receptor FceRI del mastocito, que podrían activar y favorecer la degranulación de los eosinófilos, esta reacción máxima a las 6 horas coincide con la fase tardía de la reacción alérgica de tipo inmediato.
La cuantificación de las proteínas granulares del eosinófilo puede considerarse como un parámetro útil en el estudio de pacientes afectos de enfermedades alérgicas donde el componente inflamatorio interesa ser monitorizado.

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