MARCADORES DE LA INFLAMACION EOSINOFILICA EN ORINA Y SU UTILIDAD PARA LA EVALUACION DEL ASMA

Autor: Dr. Tomás Chivato Pérez.
Servicio de Alergia. Hospital Universitario del Aire. Madrid.

INTRODUCCION

En la actualidad se acepta que el asma es una enfermedad inflamatoria crónica de las vías aéreas en la que participan numerosas células. Además se ha demostrado la importancia de diversos mediadores químicos liberados por estas células proinflamatorias que se pueden determinar tanto en diferentes fluidos biológicos (suero, lavado broncoalveolar, exudado nasal, esputo e incluso orina) como en los propios tejidos.
Se conoce desde hace varias décadas la existencia del aumento del número de eosinófilos y de sus productos en sangre periférica y esputo de pacientes asmáticos extrínsecos e intrínsecos. Se ha descrito la correlación existente entre el grado de hiperreactividad bronquial y el número de eosinófilos y sus productos en sangre periférica, esputo, lavado broncoalveolar y en los tejidos.
Existen unos mediadores preformados almacenados en el interior de los gránulos intracitoplasmáticos del eosinófilo. Los cuatro componentes básicos preformados son la proteína catiónica del eosinófilo (ECP), la proteína X del eosinófilo o neurotoxina derivada del eosinófilo (EPX/EDN), la peroxidasa del eosinófilo (EPO) y la proteína básica mayor (MBP). De todas estas proteínas, únicamente se han realizado estudios en orina de pacientes asmáticos con la EPX. Otras proteínas derivadas del interior de los gránulos de los eosinófilos han sido estudiadas en orina en otras enfermedades: parasitarias (Schistosomiasis,...), tumorales (Enfermedad de Hodgkin,...), rechazo de transplante renal o urológicas (cistitis eosinofílica,...).
Christer Peterson descubrió la EPX en 1983. Se trata de una glicoproteína monocatenaria altamente básica. Tiene un peso molecular de 23000 en su forma no reducida y de 19000 en su forma reducida. Se caracteriza por tener una actividad ribonucleasa 100 veces superior a la ECP. Posee propiedades citotóxicas como lo demuestran las lesiones que produce in vitro en el tejido cerebral de animales de experimentación, pero no se ha demostrado que produzca lesiones en el epitelio respiratorio. Como la ECP, también inhibe la proliferación de linfocitos T.
Los objetivos del presente trabajo fueron:
1) Evaluar la relación entre los niveles de EPX en suero, esputo y orina de pacientes asmáticos extrínsecos e intrínsecos.
2) Estudiar la posible correlación entre la EPX y las pruebas de función respiratoria y tiempo de evolución de la enfermedad.
3) Evaluar el grado de correlación entre los niveles de EPX en los distintos fluidos estudiados.

MATERIAL Y METODOS

Pacientes

Se han estudiado 77 pacientes procedentes de las consultas externas de los Servicios de Alergia de los Hospitales del Aire y Gregorio Marañón (adultos e infantil) y de Neumología del Aire de Madrid. Se clasificaron los pacientes en 4 grupos:
I) Asmáticos extrínsecos adultos (mayores de 15 años) = 29.
II) Asmáticos extrínsecos niños (menores de 15 años) = 13.
III) Asmáticos intrínsecos = 22.
IV) Grupo control = 13 sujetos sanos.

Pruebas cutáneas

Se realizaron pruebas cutáneas utilizando lancetas de prick (Dome Hollister Stier-Bayer. Gran Bretaña). Se llevó a cabo una batería de neumoalergenos que incluía: pólenes de gramíneas, árboles y malezas, ácaros del polvo doméstico, epitelios y hongos ambientales (ALK-Abelló. Madrid). Se utilizaron histamina (10 mg/ml) y suero fisiológico como control positivo y negativo respectivamente.

Espirometría

Los pacientes realizaron una espirometría y curvas de flujo-volumen basales. El espirómetro utilizado fue un Pneumoscreen-II (Erich Jaseger, GmbH&co. Alemania).

Recogida de muestras

El suero se recogió siguiendo las recomendaciones standard para valoración de proteínas del eosinófilo. Se realizó extracción hemática mediante sistema Vacutainer. Se dejó coagular la muestra a temperatura ambiente durante 60 minutos. Se separó el suero mediante centrifugación durante 10 minutos a 1200 g. Se alicuotaron y congelaron las muestras a 20°C hasta la posterior determinación de EPX. Se realizaron recuento y fórmula leucocitaria.
Las muestras de orina se recogieron a primera hora de la mañana. Se estudió la concentración de creatinina en orina mediante el método de picrato alcalina (Reacción de Jaffés, Boehringer Mannheim GmbH. Alemania). Se alicuotaron y congelaron las muestras a 20°C hasta la posterior determinación de EPX.
Se recogieron muestras de esputo, obteniéndose de forma espontánea. Se incubaron las muestras con N-acetil cisteína durante 60 minutos. Se centrifugó y se separó el sobrenadante. Se alicuotaron y congelaron las muestras a 20 °C hasta la posterior determinación de EPX.

Determinación de EPX

Se realizó mediante radioinmunoensayo competitivo específico (Pharmacia&Upjohn Diagnostics. Uppsala. Suecia). La sensibilidad del ensayo es < 3 5g/l. El coeficiente de variación intra e inter ensayo es < 10%.
Antes de realizar la determinación de EPX en las muestras de orina, estas fueron diluidas 10 veces en un buffer fosfato: pH 7,4, ClNa 0,15 M, BSA 1%, Tween 20 0,1%, EDTA 10 mM y CTAB 0,2%.

Tratamiento estadístico

El análisis estadístico se llevó a cabo utilizando los programas StatView SE y Graphics TM. La comparación entre los distintos grupos se realizó mediante el test no paramétrico de Mann-Whitney. Se calculó el coeficiente de correlación de Pearson para evaluar la asociación entre las variables. El nivel de significación aceptado en todos los casos fue el correspondiente a un error alfa (p) menor de 0,05.

RESULTADOS

En la Tabla I se muestran la edad, FEV1, tiempo de evolución de la enfermedad y recuento de eosinófilos en sangre periférica.
Todos los pacientes de los grupos I y II presentaron pruebas cutáneas positivas a pólenes. Los pacientes de los grupos III y IV mostraron negatividad a los neumoalergenos estudiados.
Se observaron diferencias en los recuentos de eosinófilos entre los grupos I y III (p < 0,04), II y III (p < 0,006) y III y IV (p < 0,009).
En la Tabla II se representan los niveles de EPX en suero (S-EPX), orina (U-EPX) y esputo (Sp-EPX).
Se observaron diferencias en las concentraciones de S-EPX entre los grupos I y IV (p < 0,007).
Se observaron diferencias en las concentraciones de U-EPX entre los grupos I y II (p < 0,002), I y IV (p < 0,004), II y IV (p < 0,006) y III y IV (p < 0,003).
Las diferencias entre las concentraciones de Sp-EPX de los grupos I y III fueron estadísticamente significativas (p < 0,05).
Se observó una correlación positiva 0,41 (p < 0,002) entre los niveles de S-EPX y U-EPX (Figura 1). No se observó correlación entre los niveles de EPX estudiados y valores de FEV1 ni con el tiempo de evolución de la enfermedad.

DISCUSION

A pesar de haber sido descubierta hace casi 15 años la EPX/EDN, existen escasos trabajos en relación con esta proteína del eosinófilo. Recientemente se han publicado 2 interesantes trabajos de la EPX en orina de pacientes asmáticos.
Metso y cols. han evaluado diferentes métodos diagnósticos in vivo e in vitro con la finalidad de confirmar el diagnóstico precoz en pacientes asmáticos leves. La sensibilidad del estudio de EPX en orina en el diagnóstico precoz del asma fue del 39%, superior al recuento de eosinófilos (26%), eosinófilos en esputo (35%) y EPX en suero (26%) e igual a la determinación de EPX en esputo (39%).
Zubeldia y cols. estudiaron los niveles de EPX en orina de pacientes asmáticos en comparación con un grupo de bronquitis crónica y encontraron niveles estadísticamente significativos más elevados en los sujetos diagnosticados de asma bronquial.
Kristjánson y cols. han estudiado en niños asmáticos tratados con fármacos antiinflamatorios los niveles de EPX en orina durante 3 meses. Los datos obtenidos sugieren que la EPX indica las diferentes fases de actividad y posterior control del asma tras el tratamiento antiinflamatorio.
Es importante recordar que las concentraciones séricas normales de EPX son 17,7 5g/l (8,2-38,5). En orina los valores normales son en adultos 37,5 5g/l (18-59) y en niños 9,5 5g/l (2,5-16). Si se expresan en 5g/mmol de creatinina son: en adultos 34 (11,4-101,3) y en niños 26,2 (4,6-148,2). En esputo no existen "cifras normales" de EPX.
En nuestros resultados los niveles elevados de EPX en suero y orina de pacientes asmáticos sugieren una activación sistémica de los eosinófilos. Los niveles séricos de EPX en asmáticos alérgicos en suero, tanto en adultos como en niños, fueron más elevados que en los pacientes no alérgicos. Este dato sugiere que los pacientes alérgicos podrían tener una mayor activación sistémica de los eosinófilos.
Los niveles elevados de EPX en esputo en pacientes asmáticos adultos, alérgicos y no alérgicos, indican una importante activación local de los eosinófilos. Los valores de EPX en esputo son 5 y 25 veces más altos respectivamente en pacientes alérgicos y no alérgicos en comparación con los resultados obtenidos en suero.
Los recuentos elevados de eosinófilos en los pacientes asmáticos intrínsecos, sin incremento de los niveles de EPX en suero, sugieren una menor activación sistémica de los eosinófilos. Y por otra parte, los niveles más elevados de EPX en esputo observados en el grupo de pacientes asmáticos intrínsecos indican una mayor activación local de los eosinófilos.
Finalmente la correlación existente entre los niveles de EPX en suero y orina permitiría estudiar la activación eosinofílica de los pacientes asmáticos en ambos fluidos.
Podemos concluir afirmando que la determinación de EPX en diferentes fluidos, entre otros la orina, podría ser una herramienta válida en el diagnóstico; evaluación de la gravedad, seguimiento y diagnóstico diferencial del asma bronquial.


AGRADECIMIENTO

Este trabajo se realizó gracias a una Beca de investigación de la Fundación de la S.E.A. e I.C.

BIBLIOGRAFIA

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5. Metso, T.; Kilpiv, K.; Bjvrkstén, F.; Kiviranta, K.; Haahtela, T. Can early asthma be confirmed by laboratory tests? Allergy 1996; 51: 226-231.
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