LA DETERMINACION DE LOS MARCADORES DE ACTIVACION EOSINOFILICA. INFLUENCIA DE LA MEDICACION ANTIASMATICA

Autora: Mª Dolores Hernández Fernández de Rojas.
Médico Adjunto del Servicio de Alergia. Hospital La Fe. Valencia

Los eosinófilos juegan un papel esencial en la inflamación que acontence en los procesos alérgicos1. La eosinofilia es por tanto una característica de estas enfermedades.
Sin embargo, la presencia de eosinófilos en sangre periférica constituye tan sólo un reflejo de los fenómenos inflamatorios que afectan a los tejidos. En el caso de los procesos alérgicos que afectan a las vías respiratorias, tales como la rinitis y especialmente el asma bronquial, el grado de intensidad del proceso se ha relacionado con la presencia de eosinófilos en las vías aéreas y concretamente con el grado de activación de estos eosinófilos.
La activación de los eosinófilos se ha relacionado con la liberación por parte de estas células de sus proteínas granulares. Estas proteínas han sido objeto de múltiples estudios durante los últimos años2, 3, con el fin de encontrar nuevos parámetros de laboratorio que puedan emplearse para el diagnóstico del asma bronquial así como para la evaluación del grado de severidad y actividad de ésta y la monitorización de su evolución.
La proteína catiónica del eosinófilo (ECP, eosinophilic cationic protein) puede ser medida de forma rutinaria por existir una técnica comercializada con este fin (ECP FEIA, Pharmacia, Suecia). Otras proteínas secretadas por los eosinófilos en respuesta a su activación son la neurotoxina o proteína X del eosinófilo (EPX, eosinophil protein X) y la peroxidasa del eosinófilo (EPO, eosinophil peroxidase). La EPX y la EPO pueden también medirse en suero y otros fluidos biológicos (orina, esputo, lavado nasal, lavado broncoalveolar, etc.).
Cuando comenzamos a utilizar la determinación de los niveles de las proteínas granulares de los eosinófilos nos preguntamos cuál sería el efecto que tendrían las diferentes terapéuticas que los pacientes asmáticos recibían sobre las determinaciones en suero de estos marcadores. Esta cuestión es de especial interés en el caso de los pacientes con asma bronquial severo, que difícilmente pueden suspender toda su medicación con el fin de poder determinar sus niveles basales de los diferentes marcadores.
Los corticoides, tanto por vía inhalatoria como por vía sistémica tienen efectos conocidos sobre la activación, reclutamiento y degranulación de las células que participan activamente en los fenómenos patogenéticos subyacentes en el asma bronquial. Estos efectos antiinflamatorios han sido demostrados tanto in vitro como in vivo. Las cromonas (cromoglicato disódico y nedocromil sodio), fármacos empleados exclusivamente por vía inhalatoria, ejercen sus efectos por medio de la estabilización de la membrana de los mastocitos, impidiendo o disminuyendo la liberación de mediadores por parte de estas células. Pocos trabajos han sido realizados sobre las acciones antiinflamatorias de las teofilinas puesto que durante los últimos años han sido postergadas del arsenal terapéutico del asma bronquial debido a sus potenciales efectos adversos. Su uso se restringe a los casos de asma bronquial severo, en los que se aplican todos los recursos terapéuticos disponibles y a los casos de asma nocturno. Recientemente algunos investigadores han observado que dichas acciones son evidentes y se obtienen a niveles plasmáticos inferiores a los requeridos para obtener broncodilatación4.
Los efectos antiinflamatorios de la terapéutica antiasmática se pueden evidenciar mediante la determinación de los denominados marcadores de la inflamación5. Se sabe que los corticoides, tanto sistémicos como inhalados, disminuyen los niveles de ECP en suero, fluido nasal y lavado broncoalveolar. Se han observado efectos similares para la EPO y la EPX6. Respecto al cromoglicato y nedocromil sódico, los efectos de estos fármacos sobre las proteínas granulares de los eosinófilos han sido menos estudiados y en cualquier caso son menos notorios que los corticoides. Los broncodilatadores beta-adrenérgicos se sabe que no alteran los niveles de proteínas granulares de los eosinófilos, confirmando así su falta de acción antiinflamatoria y su exclusivo efecto broncodilatador7. La inmunoterapia sí que tiene un reconocido efecto sobre la activación eosinofílica desencadenada en relación con la exposición alergénica8. Las teofilinas, hasta muy recientemente, no han sido consideradas como agentes responsables de efectos sobre la activación de los eosinófilos.
El objetivo del trabajo que se va a describir fue el establecer si las teofilinas, los corticoides inhalados y el nedocromil sodio tienen efectos sobre los niveles séricos de las proteínas granulares de los eosinófilos.

PACIENTES Y METODOS
Se seleccionaron 28 pacientes (10 varones/18 mujeres) con edades comprendidas entre los 13 y 66 años (media 28,2 años), que habían sido diagnosticados con anterioridad de asma bronquial leve, con o sin rinitis asociada. Todos los pacientes recibían como única terapéutica broncodilatadores beta-adrenérgicos "a demanda". Respecto a su condición alérgica, 21 eran asmáticos alérgicos (con pruebas cutáneas e IgE específica para algún aeroalergeno) y 7 fueron considerados como asmáticos no alérgicos (por no demostrar ni pruebas cutáneas ni IgE específica frente a aeroalergenos). En cuanto a las especificidades de los 21 individuos alérgicos, 12 eran alérgicos a ácaros del polvo doméstico, 12 a pólenes, 3 a hongos aerógenos y 3 a epitelios de animales.
El protocolo aplicado duró cuatro semanas, con visitas al comienzo del estudio (VI), tras una semana de tratamiento con teofilina retardada (V2), tras una semana de aclaramiento de la teofilina (V3) y tras dos semanas de terapéutica inhalatoria con beclometasona 500 microg dos veces al día o bien nedocromil sodio 4 mg también dos veces al día.
Durante la V1 se realizó una valoración alergológica (incluyendo pruebas cutáneas con inhalantes y determinación de IgE sérica específica), valoración funcional respiratoria (espirografía en condiciones basales), se constató que el paciente se encontraba en condiciones estables, sin haber presentado agudización de su proceso durante las últimas 8 semanas ni haber realizado más terapéuticas que broncodilatadores beta-adrenérgicos durante el mismo período. Ninguno de los pacientes era fumador. En dicha visita (VI) se obtuvo también una muestra de sangre para la determinación de proteínas granulares de los eosinófilos. Se instauró tratamiento con teofilina a dosis de 10 mg/kg/día por vía oral, dividida en dos dosis, a las 9.00 y 21.00 cada día.
Durante la V2 se repitió la valoración funcional respiratoria y la obtención de una muestra para determinación de proteínas celulares. Además se preguntó a los pacientes sobre su cumplimiento y tolerancia de la teofilina y se obtuvo una muestra para determinación de niveles plasmáticos de teofilina. Se recomendó suspender la administración de teofilina.
Tras una semana de nuevo sólo recibiendo beta-adrenérgicos inhalados si fuese necesario, se procedió a una nueva valoración funcional y toma de muestras para marcadores de activación celular y niveles plasmáticos de teofilina (V3). En esta visita se eliminaron del estudio aquellos pacientes que demostraron fallos en el cumplimiento de la terapéutica con teofilina (niveles < 3,5 microg/mL) y se dividió el grupo restante en dos subgrupos: uno compuesto por doce pacientes que iniciaron terapéutica inhalatoria con beclometasona 500 microg dos veces al día, con cámara de inhalación y un segundo sub-grupo, de trece pacientes, que inició también terapéutica inhalatoria con nedocromil sodio a dosis de 4 mg también dos veces al día y también con cámara. Esta terapéutica antiinflamatoria se prolongó durante 15 días y al final de dicho período los pacientes fueron finalmente evaluados (V4). En esta última visita se constató de nuevo la situación funcional y los niveles de marcadores de activación celular.
Las pruebas de función respiratoria se realizaron por medio de un espirógrafo de fuelle (Neumoescreen, Sanro). Como parámetros de referencia se emplearon los de la SEPAR para individuos adolescentes y adultos.
Para la determinación de los niveles de teofilina plasmática se empleó un radioinmunoensayo comercial.
La extracción de la muestra para la determinación de marcadores de activación de eosinófilos y mastocitos se realizó en tubos Vacutainer SST (Beckton Dickinson), dejando reposar la muestra durante 120 minutos para su coagulación y procediendo posteriormente a la centrifugación a 1300 g durante 20 minutos. Una vez separado el suero, se alicuotó y congeló a 20 °C.
La determinación de ECP se realizó por medio de CAP system (ECP FEIA, Pharmacia, Suecia). Las determinaciones de EPO se realizaron también por medio de CAP system (EPO FEIA) y la de EPX por medio de un radioinmunoensayo con doble anticuerpo (EPX RIA). En estos dos últimos casos los reactivos fueron proporcionados por Pharmacia (Suecia).
Para el análisis estadístico se utilizó el programa ABACU(r) para Macintosh. Para la comparación de series paramétricas y datos pareados se utilizó el test de Student, una vez normalizados los resultados tras su conversión logarítmica. Para la comparación de series no paramétricas se utilizaron el test de Mann-Whitney para la comparación de grupos y el test de Wilcoxon para grupos pareados. En cualquier caso, el nivel de significación estadística se estableció en 5%.

RESULTADOS
En las Tablas I y II se describen los parámetros funcionales y los niveles de ECP, EPX y EPO obtenidos durante la visita inicial. Como se puede observar, tanto la FVC, como el FEV1 demostraron valores medios muy próximos a la normalidad, como corresponde a un grupo de pacientes considerados como asmáticos leves. No hubo diferencia significativa entre el grupo de asmáticos alérgicos respecto de los no alérgicos.
Respecto a los niveles de proteínas granulares de los eosinófilos, los valores obtenidos estuvieron en el límite alto de la normalidad. No hubo diferencias estadísticamente significativas entre el grupo de alérgicos (p = 0,0134). No se pudieron establecer diferencias estadísticamente significativas entre los niveles de EPO correspondientes a los pacientes alérgicos a ácaros o ácaros y epitelios respecto de los alérgicos a pólenes.
Tras una semana de terapéutica con teofilina retardada, se descartaron los casos con defectos de cumplimiento y niveles inferiores a 3,5 microg/mL de teofilina plasmática. Veintitrés de los veintiocho pacientes (82,14%) cumplieron la terapéutica con teofilina tal como se había prescrito. El nivel de teofilina medio fue de 6,6 microg/mL (3,8-10,7). Como se demuestra en la Figura 1, tanto la FVC, como el FEV1 y el FEF 25-75 mejoraron sus valores respecto a los teóricos. Sin embargo las diferencias no fueron estadísticamente significativas. Respecto a los niveles de ECP, EPX y EPO, en los tres casos disminuyeron de forma significativa, como se demuestra en la Figura 2.
En la tercera visita, tras una semana de aclaramiento de la teofilina, el nivel medio de teofilina plasmática fue de 0,22 microg/mL (0-0,56). En esta visita se observó como tanto los parámetros funcionales (Figura 3), como los niveles séricos de ECP, EPX y EPO volvieron a los valores basales (Figura 4).
Respecto al grupo de pacientes que en un segundo tiempo recibieron terapéutica inhalatoria con beclometasona durante 15 días, los parámetros funcionales de nuevo no se modificaron significativamente y sin embargo sí lo hicieron los niveles séricos de ECP, EPX y EPO, que descendieron de forma significativa (Figura 5).
En el subgrupo que recibió terapéutica inhalatoria con nedocromil sódico no se observaron cambios significativos en los parámetros funcionales. Los niveles séricos de ECP, EPX y EPO disminuyeron (Figura 6), pero los cambios no demostraron significación estadística ni en el total de pacientes tratados con nedocromil sodio (n = 13) ni cuando sólo se consideró los que eran atópicos (n = 9).

DISCUSION
En este trabajo se eligió un grupo de pacientes con asma bronquial leve con el fin de poder obviar la administración de fármacos antiinflamatorios indicados en los demás grados de severidad del asma bronquial. Por ello sólo se permitió a los pacientes la utilización de broncodilatadores beta-adrenérgicos durante todo el período que duró el estudio. El grupo de pacientes seleccionados estuvo constituido mayoritariamente por pacientes con asma bronquial alérgico (21 pacientes sobre un total de 28). Los niveles medios de IgE fueron por lo tanto superiores (382,66 KU/L) a los considerados como normales. Los parámetros funcionales fueron, como corresponde a la levedad del cuadro bronquial, muy próximos a la normalidad. Sin embargo, los flujos mesoespiratorios si estuvieron por debajo de los valores teóricos en la mayoría de los pacientes.
Los niveles séricos de ECP y EPX fueron similares en el grupo de asmáticos alérgicos respecto al grupo de asmáticos no alérgicos. Sin embargo, si hubo diferencias entre ambos grupos en los niveles séricos de EPO, que fueron significativamente más elevados en el grupo de alérgicos. Los niveles séricos de EPO han sido considerados por otros autores como un buen marcador de exposición alergénica. Los pacientes alérgicos estudiados por nosotros eran en la mayor parte de los casos alérgicos a ácaros y pólenes y el estudio se realizó durante los meses de Mayo y Junio de 1994, período del año en el que, dadas las características climáticas de nuestra área, los contajes de pólenes son muy elevados (gramíneas, parietaria y olivo) y además se detectan elevadas concentraciones de alergenos mayores de ácaros comunes en el polvo doméstico. Estas circunstancias posiblemente expliquen los elevados niveles de EPO obtenidos al comienzo del estudio en el suero de los pacientes con asma bronquial alérgico.
Los cambios observados en los niveles de ECP, EPX y EPO tras una semana de tratamiento con teofilinas orales corroboran la hipótesis de un efecto antiinflamatorio de las teofilinas. Otros autores4 han demostrado como niveles bajos de teofilinas dan lugar a una significativa reducción en el número de eosinófilos EG-2 positivos (el anticuerpo EG-2 reconoce la forma secretoria de la ECP presente en los eosinófilos). Con anterioridad ya se había observado una significativa reducción de los niveles de ECP y EPX en pacientes con asma bronquial leve tras realizar tratamiento durante varios meses con teofilinas9. En nuestro trabajo los niveles de teofilinas basales estuvieron próximos al nivel inferior recomendado para obtener una broncodilatación eficaz sin riesgo de efectos adversos (5-15 microg/L). Muchos autores ya sugieren que no es necesario alcanzar dichos niveles para observar ciertas acciones terapéuticas de las teofilinas en el asma bronquial, por ello nos inclinamos a recomendar a los pacientes una dosis considerada como baja. Hay que considerar también que la posibilidad de medir los niveles plásmaticos de teofilina aporta información valiosa sobre el grado de cumplimiento de la terapéutica y en nuestro caso permitió el rechazar algunos de los casos por fallos en la cumplimentación.
Una semana después de finalizar la terapéutica con teofilinas, se inició otra terapéutica, en esta ocasión por vía inhalatoria con beclometasona o nedocromil sodio. En este momento, se supuso que el posible efecto de las teofilinas sobre los marcadores de activación celular debía haber ya revertido, devolviendo a los pacientes a su situación, basal como luego se comprobó.
Tanto los pacientes que recibieron beclometasona inhalada como los que recibieron nedocromil sodio no mostraron cambios funcionales significativos. Sin embargo, respecto a los niveles séricos de ECP, EPX y EPO descendieron en ambos grupos, aunque dicho descenso sólo fue significativo en el grupo que recibió beclometasona.
Otros autores ya han demostrado como dosis, incluso bajas de corticoides aplicadas por vía inhalatoria dan lugar a mejoría de parámetros funcionales tales como la PC20 y los flujos espiratorios, a la vez que los niveles séricos de los marcadores de activación celular disminuyen también significativamente10.
En el caso de nedocromil sodio, no hay estudios en este sentido, aunque si algunos autores han tratado de demostrar cómo el cromoglicato disódico da lugar a descensos de los niveles de ECP sérica. Ambas drogas tienen un espectro de acción similar y por lo tanto es esperable que sus efectos sobre los marcadores de inflamación sean similares. En nuestro estudio, tras quince días de terapéutica con nedocromil sodio, el descenso en los niveles séricos de ECP, EPX y EPO no fue significativo. Quizá esta falta de significación esté en relación con la corta duración de la terapéutica. Tanto en el caso del cromoglicato disódico como en el caso del nedocromil sodio, se propugna el uso de estas terapéuticas durante varios meses con el fin de evidenciar su acción antiinflamatoria. Esta acción se ha relacionado con el efecto estabilizador de la membrana de los mastocitos, que se ha atribuido a estas drogas.
En conclusión, la terapéutica con teofilinas de acción retardada da lugar en un grupo de pacientes con asma bronquial leve a descensos en los niveles séricos de proteínas granulares de los eosinófilos. Este efecto revierte una vez se suspende la administración y se comprueba el aclaramiento plasmático de la teofilina. En un subgrupo de los mismos pacientes, la beclometasona por vía inhalatoria también da lugar a un significativo descenso en los niveles de ECO, EPX y EPO, tras dos semanas de tratamiento. Sin embargo, el otro subgrupo recibió durante el mismo período nedocromil sodio, observando un descenso no significativo en los niveles séricos de los marcadores de activación de los eosinófilos.

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