MEDIADORES NO PROTEICOS EN LA INFLAMACION EOSINOFILICA

Autor: Dr. Carlos Lahoz.
Servicio de Inmunología. Fundación Jiménez Díaz.Madrid.

INTRODUCCION

El eosinófilo es una célula tisular que tiene un diámetro máximo de 10-15 nm, con un núcleo bilobulado en humanos, y de forma rueda en ratones. La característica morfológica más relevante de los eosinófilos son su gránulos citoplásmicos. Estos gránulos, al microcoscopio electrónico, están compuestos de un núcleo denso central incluido en una zona menos densa, denominada matriz. En general, los eosinófilos tienen una densidad bastante alta comparada con el resto de los leucocitos: 1.085-1.090. En síndromes de hipereosinofilia o en situaciones en donde aparecen eosinófilos activados (asma bronquial, parasitosis), la media de la densidad celular disminuye, de manera que aparece un aumento de "eosinófilos hipodensos" que son más ligeros de 1.082. La disminución de la densidad se debe a que sus gránulos son más pequeños y también es más bajo el contenido en MBP.
Actualmente se piensa que los basófilos y eosinófilos pueden proceder de una célula progenitora común, ya que poseen proteínas comunes, que se pensaba que eran exclusivas de los eosinófilos, como son la Proteína Mayor Básica (MBP) y los cristales de Charcot-Leyden, y además se han encontrado eosinófilos y basófilos en cultivos de células clonadas de médula ósea. No obstante, estas experiencias hay que analizarlas cuidadosamente, pues también se ha demostrado que los mastocitos y basófilos pueden endocitar la MBP y Peroxidasa (EPO), procedente de los eosinófilos y puede ocurrir que la presencia de estas proteínas en los basófilos y mastocitos no sea dependiente de síntesis propia, sino más bien de captación procedente del medio externo.

RECEPTORES DE SUPERFICIE DE LOS EOSINOFILOS

Los eosinófilos tienen receptores para el Fc de la IgG del tipo Fcg RII (CD32) y no expresan receptores del tipo I (CD64), y R III (CD16). La activación de los eosinófilos a través de estos receptores, da lugar a una serie de cambios, asociados principalmente con aumento de citotoxicidad. Estos receptores de baja afinidad se encuentran aumentados en pacientes con eosinofilias asociadas. Estas células carecen de receptores para IgM e IgD, sin embargo tienen receptores para el Fc de la IgE y de la IgA. Los receptores para IgE en eosinófilos humanos están restringidos a los eosinófilos de baja densidad, siendo éstos más efectivos en procesos de citolisis.
Otro tipo de antígenos que expresan los eosinófilos son las moléculas de adhesión expresando tres tipos diferentes: el LFA-1 (antígeno de función del leucocito) que es una glicoproteína de la superficie celular de los leucocitos. Contiene unidades a y b (CD11a y CD18) asociadas covalentemente, de 18.000 y 95.000 D de peso molecular respectivamente. Esta molécula participa en interacciones celulares y en adhesión de leucocitos al endotelio. También expresan Mac-1 que es un receptor para el componente del complemento C3bi y está también implicado en la adhesión de neutrófilos y monocitos. El tercer antígeno que expresan es el p150,95 que parece tener función similar a la de Mac-1, pero tiene en cierto modo una distribución celular diferente. Otra clase importante de antígenos que expresan los eosinófilos y que inicialmente fueron identificados sobre linfocitos T, son los "Very Late Antigens" antígenos VLA-2) aparecen muy tarde después de la activación de los linfocitos T por antígeno o mitógeno. Estas moléculas interaccionan con moléculas de adhesión de células vasculares (VCAM-1), y moléculas de adhesión intercelular ICAM-1 e ICAM-2 en células endoteliales, lo que explica el tráfico hacia los tejidos. La presencia de éstas moléculas es muy importante en el foco inflamatorio, tanto que si se utilizan anticuerpos monoclonales que las neutralicen, se puede inhibir la migración de los eosinófilos al foco.
Los eosinófilos expresan sobre su superficie receptores para IL-2 y la molécula CD4, que unen IL-2 y un factor quimiotáctico derivado de los linfocitos, respectivamente. Estas moléculas son importantes factores en la quimiotaxis, especialmente para los eosinófilos, y no para otros leucocitos, que carecen de los receptores citados. Esto podría explicar el selectivo reclutamiento de los eosinófilos en el foco inflamatorio en el asma y otros procesos patológicos.

MEDIADORES NO PROTEICOS FORMADOS "de novo" 
POR LOS EOSINOFILOS

La actividad más importante del eosinófilo, es su capacidad de actuar como célula efectora en las reacciones de defensa contra los parásitos. Sin embargo el potente arsenal destructivo del que disponen éstas células, las hace muy importantes en otras reacciones de hipesensibilidad, donde producen un fuerte daño tisular, agravando y cronificando los procesos flogísticos.
Trabajos hechos "in vitro", estimulando a los eosinófilos con ionóforo de calcio, zimosan opsonizado, anti-IgG o antígeno, demuestran la capacidad para liberar leucotrieno C4 y sus derivados LTD4 y LET4. Son capaces también de liberar prostaglandina E2, derivados de la actividad 15-lipoxigenasa tales como el ácido 15-monohidroxieicosatetranoico, los 15-leucotrienos y la lipoxina A. Todos estos datos sugieren la existencia de las enzimas 5-lipoxigenasa, 15-lipoxigenasa y la cicloxigenasa, necesarias para que puedan liberarse los derivados del ácido araquidónico (AA). Otro importante mediador es el PAF, (factor activador de plaquetas), que activa a estas células y a otras, como macrófagos y neutrófilos, así como un potente factor quimiotáctico para eosinófilos. Posee también acción broncoconstrictora sobre el aparato respiratorio. El PAF se sintetiza en los eosinófilos gracias a una acetil transferasa que poseen estas células.
En la Tabla I se resume la acción de los mediadores lipídicos de los eosinófilos.

SINTESIS DE LOS MEDIADORES FORMADOS de novo EN LOS EOSINOFILOS

Son muchos los tipos celulares, incluyendo a los eosinófilos, que en respuesta a un estímulo, producen Acido Araquidónico (AA), el cual es metabolizado y da lugar a la producción de uno o más derivados tales como las Prostaglandinas, Tromboxanos, y los Leucotrienos.
La liberación de Acido Araquidónico a partir de los fosfolípidos de membrana se puede producir fundamentalmente de la hidrólisis de tres compuestos: Fosfatidilcolina (PC), Fosfatidiletanolamina (PE) y Fosfatidilinositol (PI) por la acción de la Fosfolipasa A (PLA2). Además se puede generar el AA a partir del Diacilglicerol por la acción de la Diacilglicerol lipasa.
En la vía de la 5-lipoxigenasa las moléculas que poseen un radical del tipo hidroperóxido, se le conoce como HPTE (`cido hidro peroxi eicosatetraenoico), con el prefijo del número donde está situado este radical. El reconocimiento del 5-HPTE por la 5 lipoxigenasa, da lugar a un epóxido que puede ser abierto y que produce una variedad de compuestos conocidos con el nombre de leucotrienos. La 15 lipoxigenasa actúa a nivel de 15-HPTE dando lugar a la formación de la lipoxina A y la cicloxigenasa induce la liberación de prostaglandinas E y tromboxanos.
La activación de los eosinófilos en respuesta al ionóforo de Calcio da lugar a una liberación preferente del leucotrieno LTC4, a diferencia de los neutrófilos que liberan mayoritariamente LTB4. El LTC4 tiene acción bronco constrictora y aumenta la permeabilidad capilar, mientras que el LTB4 actúa aumentando la adherencia de los leucocitos a las células endoteliales.
Cuando se produce la liberación de LTC4, éste tiene una vida media muy corta, pues se inactiva por el ácido hipocloroso (HOCI) originado por la peroxidasa, también liberada en estos procesos de activación.
Hay otros estímulos de los eosinófilos que da lugar a la liberación de LTC4 (FMLP, y el PAF). Eosinófilos murinos bajo una estimulación antigénica liberan LTC4 y anión superóxido, siendo necesario que el mecanismo de control del Ca2++ permanezca intacto. Los eosinófilos infiltrados en el tejido respiratorio al principio de la fase tardía, podrían ser fuertemente activados por el AA, posiblemente en combinación con el PAF, para liberar LTC4.
Otro importante mediador es el PAF, factor activador de plaquetas y de otras células como los macrófagos y los neutrófilos. Está formado por la acción de la Fosfolipasa A2 sobre los fosfolípidos de membrana. Es liberado de plaquetas, eosinófilos, granulocitos, monocitos, macrófagos, mastocitos, linfocitos, células endoteliales, etc.
El estímulo que puede dar lugar a la liberación de PAF puede ser inmunológico (antígeno, IL1, Ac IgE) así como no inmunológico (ionóforo de Ca, factor quimiotáctico, trombina, etc.). Los efectos del PAF pueden ser directos o indirectos. Directos, el PAF se une al receptor de la superficie de la célula, la activa, y esa activación se puede medir en términos de agregación de plaquetas. Indirectamente, el PAF activa a la célula, causando la liberación de otros mediadores, por ejemplo el PAF puede activar mastocitos y éstos a su vez liberan histamina. En las plaquetas, el PAF causa activación, agregación y desgranulación liberando substancias tales como serotonina y tromboxano A2. En neutrófilos, causa agregación, desgranulación, quimotaxis, incrementa la adherencia celular, la producción de superóxido, y la de metabolitos del ácido araquidónico.
En los eosinófilos el PAF se puede sintetizar gracias a una acetil transferasa que poseen estas células. El PAF estimula la acumulación selectiva de eosinófilos en el pulmón y en la piel de sujetos atópicos. El PAF incrementa la adhesión de eosinófilos en las superficies endoteliales, lo cual debe ser la etapa inicial en el reclutamiento dentro de los tejidos.
Puesto que los eosinófilos por sí mismos son una fuente rica de PAF, ellos pueden atraer a más eosinófilos y dar lugar a un potencial para una reacción inflamatoria continuada. El PAF es muy efectivo estimulando a los eosinófilos a liberar las proteínas dando lugar a un daño en el epitelio.

METABOLITOS DEPENDIENTES DE OXIGENO

Los eosinófilos, al igual que otros granulocitos, poseen un potente metabolismo oxidativo, el cual puede ser activado por estímulos solubles o particulados. Se produce un incremento en el consumo de oxígeno que genera especies reactivas de oxígeno tales como el anión superóxido (O₂) el peróxido de hidrógeno (H₂O₂) como consecuencia de la activación de la NADPH-Oxidasa la cual se encuentra localizada en la membrana plasmática.
H₂O₂ se forma por la dismutación espontánea del O₂ y sirve como bifurcación en la producción del radical OH y el ácido hipocloroso OHCl. HOCl es un fuerte oxidante, derivado desde H₂O₂ con la participación de las peroxidasa de los leucocitos. Existen dos tipos de peroxidasa: la mieloperoxidasa en neutrófilos y monocitos y la peroxidasa del eosinófilo (EPO). La producción de estos mediadores es uno de los mecanismos de daño tisular, dependiente de oxígeno, causando ciliostasis, formación de vesículas y exfoliación del epitelio pulmonar.

OXIDO NITRICO (NO) Y RADICALES REACTIVOS DERIVADOS 
DEL NITROGENO COMO MEDIADOR DE LA INFLAMACION EOSINOFILICA

Debido a la implicación que tiene el NO en estados inflamatorios, reacciones de hipersensibilidad, y al hecho de que los eosinófilos son las células implicadas en estos desórdenes, nosotros hemos estudiado la presencia en eosinófilos humanos y en la línea eosinofílica (EoL-3) del gen de la Sintasa inducible del óxido nítrico (iNOS) que es la enzima implicada en la sítesis del NO a partir de L-arginina.
En primer lugar, hemos demostrado la presencia de la enzima en el citosol de los eosinófilos mediante inmunocitoquímica, utilizando un anticuerpo monoclonal frente a la iNOS. Esta proteína se detectó también por inmunodetección en preparaciones de eosinófilos purificados y en la línea EoL-3.
Demostramos también la existencia de mensajero para la iNOS en los eosinófilos mediante RT-PCR, y el fragmento amplificado (cADN), se clonó y se secuenció obteniendo un 97% de homología con la iNOS de monocitos y macrófagos humanos.
La enzima presente en los eosinófilos era activa, ya que era capaz de producir nitritos, midiéndose por una reacción colorimétrica (Reacción de Griess). Esta producción de nitritos, obtenida de los eosinófilos, derivaba de la vía de la L-arginina como se comprobó, ya que al añadir el inhibidor N-metilester-L-arginina a la reacción se producía una fuerte inhibición de la producción de NO.
La iNOS puede ser expresada por las células epiteliales, macrófagos y otras células inflamatorias lo que demuestra que esas células pueden liberar el mediador de forma inducida por estímulos adecuados (citocinas, mediadores lipídicos y proteícos).
Se ha demostrado que en los individuos asmáticos se expresa la iNOS en las células epiteliales mientras que en los individuos normales no se ha encontrado, posiblemente debido a que en la inflamación asmática se producen citocinas y otros mediadores que activan a las células epiteliales a expresar iNOS. La liberación de óxido nítrico es inhibida por los glucocorticoides. Existen estudios epidemiológicos que han demostrado que existe una asociación temporal entre infección viral respiratoria y exacerbación del asma. Esto podría deberse a un mecanismo implicando al NO.
Además de los efectos del NO descritos en las vías aéreas, se ha encontrado un aumento en el NO exhalado en pacientes asmáticos. El NO exhalado podría ser una medida de inflamación en el tracto respiratorio, debido a que esta medición es fácil y no invasiva, por lo que podría ser un parámetro clínico a medir, como medida de inflamación y como seguimiento de alguna terapia antiinflamatoria.
Altas concentraciones de NO de forma local tiene un efecto citotóxico. El NO puede tener también efectos dañinos en el organismo, y concretamente en el pulmón, incrementando el flujo sanguíneo, promoviendo la exudación de proteínas plasmáticas, la secreción de moco e indirectamente la proliferación de Th2, que son los linfocitos responsables de la inflamación eosinofílica.
En los tejidos inflamados en general y en los asmáticos en particular, el alto nivel de NO que se produce en los pulmones, reacciona con el anión superóxido formándose el compuesto tóxico y muy citopático denominado peroxinitrito, el cual se ha demostrado que induce hiperrespuesta en las vías respiratorias.

IMPLICACIONES TERAPEUTICAS

En condiciones patológicas como la inflamación asmática, la simultánea producción de óxido nítrico y anión superóxido, y peroxinitrito, abre una vía de estudios de nuevos fármacos que intentan controlar algunos de estos metabolitos. Así se ha descrito que la enzima superóxido dismutasa (SOD) que actúa retirando el anión superóxido del medio reduce el daño tisular. Otros posibles agentes terapéuticos serían los inhibidores selectivos de la iNOS, pero éstos están ahora en vías de estudio.
El conocimiento de los mediadores lipídicos de los eosinófilos permite una cierta modulación de los procesos inflamatorios en los que estos mediadores tienen una participación importante.
Los agonistas de los receptores b-adrenérgicos estimulan los receptores b2 de las células masculares de las vías aéreas. Se ha planteado si estas drogas pueden además actuar modulando los procesos inflamatorios. Los eosinófilos periféricos pueden tener estos receptores b2-adrenérgicos y si se incuban durante tiempos cortos con salbutamol, procaterol o formaterol se produce la inhibición de la liberación de anión superóxido que se había inducido con zimosan opsonizado o PMA.
Igualmente la teofilina que actúa inhibiendo la fosfodiesterasa con elevación del AMP cíclico, inhibe la liberación de superóxido y la producción de tromboxano por los eosinófilos pero hay que utilizar concentraciones más bien altas como 10,3 M.
Utilizando inhibidores tipo rolipran, selectivos de la fosfodiesterasa (PDE) IV que es la isoenzima más abundante en los eosinófilos y en los neutrófilos, se inhibe la formación de anión superóxido que había sido previamente estimulada por el leucotrieno B4, PAF o zimosan opsonizado. Existen evidencias de que los inhibidores de esta enzima disminuyen la expresión de los genes para IL-4 e IL-5 en células Th2.
En la terapéutica antiasmática es una buena solución combinar el uso de los inhibidores de la PDE III y los de la PDE IV, pues con los primeros se favorece la relajación del músculo liso bronquial y con los de la PDE IV se mejoran los síntomas inflamatorios por inhibición de la liberación de mediadores.

BIBLIOGRAFIA RECOMENDADA

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