SEGUNDA PONENCIA:
UTILIDAD PRACTICA DE LA DETERMINACION DE TRIPTASA EN EL DIAGNOSTICO DE LAS ENFERMEDADES ALERGICAS

MODERADORA:
Dra. Mª Luisa Sanz.
Médico Adjunto del Servicio de Alergia Hospital Universitario de Navarra. Pamplona.


CUANTIFICACION DE LA TRIPTASA SERICA EN PACIENTES CON ANAFILAXIA

Autora: Concepción Sánchez Fernández. 
Servicio de Alergia (con la colaboración del Servicio de Inmunología). 
Hospital Ramón y Cajal. Madrid.

INTRODUCCION

La triptasa es una proteasa neutra que se encuentra preformada en los gránulos secretores de los mastocitos humanos siendo liberada, junto con otros mediadores, cuando se produce la activación y consiguiente degranulación de los mastocitos (1). La triptasa se ha encontrado en dos de los tres tipos de mastocitos humanos descritos (2, 3) pero no está presente en otros tipos de células, excepto en los basófilos, donde se encuentra en cantidades insignificantes (300 a 700 veces menos que en los mastocitos del pulmón y de la piel) (4).
Los mastocitos activados secretan, además de la triptasa, otros mediadores preformados, incluyendo histamina, proteoglicanos y otra proteasa neutra llamada quimasa, así como mediadores generados de novo como prostaglandina D2, leucotrieno C4 y factor activador de las plaquetas (5). Todos estos mediadores son potencialmente útiles como marcadores de la activación mastocitaria. Sin embargo, a excepción de lo que ocurre con la triptasa, estos mediadores o bien son producidos por otras células además del mastocito, por lo que la medición de los mismos no es específica de activación mastocitaria, o bien es técnicamente difícil cuantificarlos en Ios distintos fluidos biológicos.
La histamina, medida en plasma o en otros fluidos corporales, ha sido el mediador mastocitario más estudiado hasta la actualidad, presentando las siguientes características:

- una vida media de muy pocos minutos, alcanzando niveles máximos, en la circulación periférica, a los 10-15 minutos después de la activación mastocitaria y retornando a niveles basales en 30 minutos;
- también está presente en los basófilos en cantidades importantes, por lo que no es un marcador exclusivo de los mastocitos;
- es preciso un manejo muy cuidadoso de las muestras para evitar la hemólisis y la degranulación de los basófilos, con la consiguiente elevación artificiosa de los niveles de histamina en la circulación.

Frente a lo anterior, la triptasa presenta las siguientes cualidades:

- aunque se libera de forma paralela a la histamina de los mastocitos activados (6), no se suele detectar en la circulación hasta 30 minutos después, probablemente por la lenta capacidad de difusión a través de la matriz extracelular, al formar un complejo unido a proteoglicanos;
- tiene una vida media in vivo de 2 horas, con niveles pico en la circuladón entre 1 a 2 horas tras su liberación, no retornando a niveles basales en la circulación periférica hasta 4-6 horas después (1,7);
- sus niveles no se afectan significativamente en muestras de suero sometidas a varias ciclos de congelación-desongelación o tras incubación a temperatura ambiente y a 37°C hasta 4 días (8) y, por otro lado, la cantidad de triptasa procedente de los basófilos es prácticamente despreciable, por lo que no es necesario un manejo muy cuidadoso de las muestras de sangre, una vez extraídas.

La selectiva presencia de la triptasa en los mastocitos, la prolongada vida media y, el momento de alcanzar sus niveles pico en la circulación periférica, en relación a la histamina, que permite una demora en la recogida de las muestras y, por último, la posibilidad de manejar las muestras sin excesivo rigor, hacen que la triptasa pueda ser, actualmente, el marcador más útil de los mastocitos activados.
Por lo expuesto anteriorrnente nos propusimos medir la triptasa sérica en pacientes que presentaron reacciones anafilácticas y/o anafilactoides de distinto grado de severidad y con diferentes etiologías.

METODOS

1.- Sujetos.

a) Pacientes.

Los pacientes fueron escogidos de dos lugares distintos:

- Servicio de Urgencias de nuestro hospital, donde habían acudido por padecer una reacción anafiláctica;
- Laboratorio del Servicio de Alergia, donde presentaron reacciones al realizarse provocaciones controladas con fármacos o tras administración de inmunoterapia.
En total se recogieron 19 pacientes, 9 mujeres y 10 varones, con una edad media de 39,1 años (rango 20-62).

b) Controles.

Se escogieron 24 personas sanas sin clínica de atopia y con IgE total sérica dentro de límites normales (< 85 KU/L, realizada por CAP System del Laboratorio Pharmacia). De ellos 11 fueron mujeres y 13 varones, con una edad media de 29,3 años (rango 18-50).
Las muestras de sangre se tomaron por punción de una vena periférica y centrifugadas para la obtención de suero. La extracción de las mismas se realizó entre 1 a 3 horas después del inicio de los síntomas, excepto un caso en que se hizo a las 11 horas. Además se tomaron muestras de sangre al menos 15 días tras la desaparición de la clínica para medir la triptasa basal.

2.- Medición de la triptasa sérica.

Se utilizó el llamado UniCAP para la triptasa, del laboratorio Pharmacia, el cual es un fuoroenzimainmunoensayo (FEIA), a diferencia del radioinmunoensayo (RIA) que se ha venido utilizando en la mayoría de trabajos publicados hasta la actualidad (9). El utilizar una u otra técnica tiene su importancia, como se explica a continuación, además del inconveniente de utilizar isótopos radiactivos en el RIA.
Se han descrito dos formas de triptasa, las llamadas a y b-triptasa, respectivamente (10-12), y se ha visto que la a-triptasa es la forma predominante en la circulación periférica tanto en condiciones basales en sujetos normales como en pacientes con mastocitosis sistémica, encontrándose muy elevada en estos últimos. Sin embargo, parece ser que la forma que se eleva predominanternente cuando hay una reacción alérgica es la b-triptasa (13). Pues bien, el RIA utiliza un anticuerpo monocional de ratón llamado G 5 que captura mucha menos triptasa "y por tanto, se detecta menos" que el anticuerpo monoclonal B 12 utilizado en el FEIA actual y esto pudiera ser debido a que el anticuerpo B 5 sólo detecte la b-triptasa, mientras que el B 12 detectaría tanto la a como la a-triptasa Esto explicaría por qué la triptasa basal con el RIA es casi siempre indetectable siendo claramente detectable con el nuevo método y, sin embargo, que exista una correlación lineal en los valores de la triptasa tras una reacción anafiláctica al comparar los dos métodos (14).


RESULTADOS

Todos nuestros controles tuvieron una triptasa sérica por debajo de 5 5g/L y, de hecho, en la mayoría fue menor a 3 5g/L (Figura 1).
En 14 de nuestros 19 pacientes los niveles de triptasa sérica alcanzados tras presentar los síntomas fueron claramente mayores que los de nuestros sujetos control, es decir, mayor de 5 5g/L, mientras que en 5 de los pacientes fueron menores. La triptasa basal sólo se pudo obtener en 11 de los pacientes y en éstos, la triptasa tras la reacción, fue más del doble de la basal en 7 de ellos y similar a la basal en los 4 restantes, siendo estos últimos aquellos pacientes en los que la triptasa tras los síntomas había sido menor de 5 5g/L (Figura 2).
Para analizar los resultados obtenidos los pacientes se dividieron en tres grupos según tuvieran la triptasa sérica tras la reacción, menor de 5, entre 5 a 10 y mayor de 10 5g/L. El límite de 5 se escogió porque todos nuestros controles estaban por debajo del mismo y el límite de 10 porque éste constituye la media más dos desviaciones estándar de un amplio grupo control (83 sujetos) utilizado por Schwartz y col. (14) usando un método similar al nuestro, con anticuerpos monoclonales B 12.
Los 5 pacientes con triptasa menor de 5 5g/l tuvieron en todos los casos únicamente síntomas cutáneos muy leves, excepto el n° 16 que asoció tos de poca intensidad; tampoco fue importante el edema labial del paciente n° 19. En todos ellos la triptasa tras la reacción fue similar a la basal, incluso en un caso resultó ligeramente por debajo de la basal (Tabla 1).
Hubo 4 pacientes con triptasa entre 5 y 10 5g/L, en ninguno de los cuales se pudo obtener triptasa basal. Aunque sólo presentaron síntomas cutáneos, como el grupo anterior, sin embargo, éstos fueron más extensos y floridos (Tabla 2).
En los 10 pacientes restantes la triptasa fue mayor de 10 5g/L. De ellos, 3 presentaron únicamente urticaria-angioedema pero en todos la urticaria fue generalizada y el edema intenso, afectando fundamentalmente párpados y labios. El paciente n° 15 también tuvo afectación únicamente cutánea pero consistió en una eritrodermia intensa y generalizada con una descamación fina, sin afectación de mucosas, que se inició con un tiempo de latencia de 8 horas tras la administración de un jarabe conteniendo codeina, efedrina y benzoato sódico, entre otras sustancias y aunque estos síntomas no son típicos de una reacción anafiláctica, la activación de los mastocitos fue evidente por el valor elevado de la triptasa. Los otros 6 pacientes presentaron una clínica más severa con afectación respiratoria o digestiva además de la cutánea y 3 de ellos tuvieron una hipotension grave (Tabla 3).

COMPARACION DE NUESTROS DATOS CON LA BIBLIOGRAFIA 
Y DISCUSION

En estudios previos (14, 15, 16) se ha inforrnado que los niveles de triptasa sérica tienen una correlación positiva con la severidad de los síntomas, de modo que los más elevados corresponden a los casos de shock anafiláctico, lo cual también vemos en nuestro estudio (Figura 3) a pesar de que 2 de nuestros pacientes con hipotensión grave tuvieron una triptasa únicamente de 12,6 y 11,6 5g/L, lo cual puede ser debido a que las muestras se recogieron a las 3 y a las 11 horas, respectivamente, es decir, después de que la triptasa alcance sus niveles pico en la circulación.
Schwark y col. (14) encuentran que la media de los valores de triptasa basal en 17 sujetos alérgicos a veneno de himenópteros que presentan un shock anafiláctico tras provocación con picadura de himenópteros es estadísticamente más elevada que la encontrada en los 44 pacientes también alérgicos a himenópteros que tras la provocación no reaccionaron o tuvieron síntomas más leves concluyendo que el nivel de triptasa basal podría ser un factor de riesgo para reacciones sistémicas severas tras provaciones alergénicas en sujetos sensibles. En los 11 pacientes de nuestro estudio en los que conseguimos una muestra basal (Figura 4) los valores de triptasa están dispersos independientemente de la severidad clínica y no se puede concluir nada al respecto.
Un punto que creo es importante y sobre el que apenas se discute en la bibliografía revisada es qué nivel de triptasa debemos considerar elevado, indicando activación mastocitaria. Así, aplicando distintos criterios, vemos los resultados tan dispares que obtendríamos en nuestro estudio:

- Schwartz y col. en su artículo de 1994 (14) establecen el punto de corte en 10,5g/L porque representa la triptasa media más 2 desviaciones estándar de sus sujetos control. Este criterio lo cumplen 10 de nuestros 19 pacientes, un 52%. Sin embargo Schwartz en ese mismo trabajo encuentra, por un lado, que 3 de sus casos control, que no son alérgicos y están sanos, tienen una triptasa mayor de 10 y, por otro lado, algunos de los que presentaron reacciones leves tienen una triptasa menor de 10; además, comprueba aue la triptasa medida a los 60 minutos tras la reacción es, desde un punto de vista estadístico, significativamente mayor que la basal en todos los pacientes que presentaron síntomas tras la provocación, independientemente de su severidad, por lo que se plantea que resulta más sensible, como indicador de activación mastocitaria, el incremento relativo de la triptasa sobre la basal en lugar de establecer un punto de corte en un valor absoluto. Bajo este último planteamiento 8 de mis 11 pacientes de los que conocemos la basal, un 72%, tendrían la triptasa elevada.
- Si seguimos las recomendaciones actuales del laboratorio Pharmacia de escoger el límite en 13,5 5g/I, por ser el percentil 95 de sus 129 sujetos control, sólo 6 de mis pacientes, un 31%, tendrían la triptasa elevada; sin embargo el percentil 95 de mis controles es 4,7 5g/l, lo que cumplen 14 de mis pacientes, un 73%.

Por último, creo que se debería reevaluar cúal es el curso temporal de la triptasa en la circulación periférica ya que aunque Schwartz lo estableció en 1989 (7), este mismo autor en su trabajo de 1994 (14), con el nuevo método de medición de la triptasa, encuentra los niveles pico entre 15 a 60 minutos en lugar de entre 1 a 2 horas; y, por nuestra parte, el paciente n° 10 presentó una triptasa a las 11 horas mucho mayor que la basal.

CONCLUSIONES

1) La triptasa sérica aumenta claramente en pacientes con reacciones anafilácticas o anafilactoides si éstas alcanzan una cierta intensidad. Además se ve una correlación positiva entre los niveles de triptasa sérica y el grado de severidad clínica, en concordancia con lo previamente publicado. Sin embargo, no hemos encontrado una relación clara entre el nivel de triptasa basal y la gravedad de los síntomas.
2) Es necesario realizar estudios con muestras más amplias y con el nuevo método para valorar mejor el aumento de la triptasa en reacciones leves o moderadas, donde la triptasa podría ser una ayuda importante en el diagnóstico.
3) Debemos establecer un criterio para saber cuándo consideramos la triptasa elevada, o bien encontrando un "punto de corte" que nos ofrezca una sensibilidad y especificidad adecuada, o bien estudiando la validez del incremento de la triptasa sobre el nivel basal en cada individuo.
4) Es importante establecer de nuevo el tiempo en que se alcanzan niveles pico de triptasa en circulación periférica para evitar los falsos negativos.

BIBLIOGRAFIA

1. Alter, S.C.; Schwartz, L.B. Tryptase: an indicator of mast cell-mediated allergic reactions. Spector SL (ed). Provocative Challenge Procedures. Background and Methodology, Futura Publishing Company, Inc., Mount Kisco, NY, 1989: 167-183.
2. Irani, A.M.; Schechter, N.M.; Craig, S.S., et al. Two types of human mast cells that have distinct neutral protease composition. Proc Natl Acad Sci USA 1986; 83: 4464-4468.
3. Weidner, N.; Austen, K.F. Evidence for morphologic diversity of human mast cells. Lab Invest 1990; 63: 63-72.
4. Castells, M.C.; Irani, A.M.; Schwartz, L.B. Evaluation of human peripheral blood leukocytes for mast cell tryptase. J Immunol 1987; 138: 2184-2189.
5. Schwartz, L.B. The mast cell. In: Kaplan AP, ed. Allergy. New York: Churchill Livingstone, 1985: 53-92.
6. Schwartz, L.B.; Lewis, R.A.; Seldin, D., et al. Acid hydrolases and tryptase from secretory granules of dispersed human lung mast cells. J Immunol 1981; 126: 1290-1294.
7. Schwark, L.B.; Yunginger, J.W.; Miller, J., et al. Time course of appearance and disappearance of human mast cell tryptase in the drculation after anaphylaxis. J Clin Invest 1989; 83: 1551-1555.
8. Schwartz, L.B.; Atkins, P.C.; Bradford, T.R., et al. Release of tryptase together with histamine during the immediate cutaneus response to allergen. J Allergy Clin Immunol 1987; 80: 850-855.
9. Enander, I.; Matsson, P.; Nystrand, J., et al. A new radioimmunoassay for human mast cell tryptase using monoclonal antibodies. J Immunol Methods 1991; 138: 39 46.
10. Miller, J.S.; Westin, E.H.; Schwartz, L.B. Cloning and charaderization of complementary DNA for human tryptase. J Clin Invest 1989; 84: 1188-1195.
11. Miller, J.S.; Moxley, G.; Schwark, L.B. Cloning and characterization of a second complementary DNA for human tryptase. J Clin Invest 1990; 86: 864 870.
12. Little, S.S.; Johnson, D.A. Human mast cell tlyptase isoforms: separation and examination of substrate-specificity differences. Biochem J 1945; 307: 341-346.
13. Schwark, L.B.; Sakai, K.; Bradford, T.R., et al. The a form of human tryptase is the predominant type present in blood at baseline in normal subjects and is elevated in those with systemic mastocytosis. J Clin Invest 1995; 96: 2702-2710.
14. Schwartz, L.B.; Bradford, T.R.; Rouse, C. et al. Developrnent of a new, more sensitive immunoassay for human tryptase: use in systemic anaphylaxis. J Clin Immunol 1994; 14: 190-204.
15. Van der Linden, P.G.; Hack, C.E.; Poortman, J., et al. Insect-sting challenge in 138 patients: relation between clinical severity of anaphylaxis and mast cell activation. J Allergy Clin Immunol 1992; 90: 110-118.
16. Ordoqui, E.; Zubeldia, J.M.; Aranzabal, A., et al. Serum tryptase levels in adverse drug reactions. Allergy 1997; 52: 1102-1105.