CARACTERÍSTICAS INMUNOQUÍMICAS DE LA SENSIBILIZACIÓN A ALFA AMILASA

Dr. Juan Blanco Carmona.
Sección Alergología. Hospital General Yagüe. Burgos

Las amilasas fueron las primeras enzimas que se añadieron a la masa del pan, siendo aún en la actualidad motivo de gran interés en investigación dentro de los enzimas utilizados en panadería (1). Hasta ahora han sido tres las fuentes empleadas para su obtención: alfa-amilasa procedente de harina de malta, que históricamente fue la primera utilizada, de origen fúngico (Aspegillus oryzae) y de origen bacteriano (Bacillus subtilis).
En principio, se usó este enzima para la producción de azúcares fermentables.
El almidón, principal componente de las harinas de los cereales está constituido por un 75% de amilopectina y un 25% de amilosa. Sobre éstas actúa la alfa amilasa rompiendo al azar, a excepción de los terminales, los enlaces alfa 1,4 glicosídicos produciendo maltosa y sobre todo dextrinas. Sobre estas últimas actúa la beta amilasa que hidroliza los enlaces 1-4-glicosídicos terminales de manera secuencial liberando así maltosa. La maltosa es posteriormente fermentada por la levadura dando lugar a la producción de gas (CO₂) del que depende de forma directa el volumen de la masa.
La harinas de los cereales contienen suficiente cantidad de beta-amilasa. Sin embargo, la cantidad de alfa-amilasa es muy variable dependiendo de variaciones e influencias climatológicas en cada cosecha .Esto hace que, en la mayoría de las ocasiones, su presencia deba ser corregida, por lo general añadida, en la fábrica de harinas.
Por otra parte, ya en la panadería, se usará como constituyente de los mejorantes panarios. Estos compuestos añaden enzimas como pentonasas, hemicelulasas,xilanasas, glucoamilasas y amiloglucosidasas y en mayor proporción alfa-amilasas; proteasas, lipoxigenasas etc. El hecho de que la acción descrita de dicho enzima desaparezca a temperaturas entre 70 y 75°C, evita una excesiva rotura del almidón que podría llevar a la producción de una miga apelmazada. Así mismo al ser horneado el pan a temperaturas superiores a 200°C hace que no exista peligro en su dosificación. Por ello, y aunque por lo general se utiliza en una relación 0,01% respecto a la cantidad de harina, es difícil saber que cantidad de alfa amilasa puede existir en los productos de panadería. El hecho de que la alfa amilasa procedente de la harina de malta se inactive a temperaturas superiores, induzca un arranque más rápido de la fermentación y aporte actividades proteolíticas no controlables fácilmente ha hecho que dicha fuente haya caído en desuso.
Otra de las ventajas de utilizar harinas con un correcto nivel de alfa amilasa es que ello permite un mejor tostado de la corteza y aroma, asimismo dependientes de la presencia de maltosa y, siendo éste uno de los capítulos de mayor investigación en la actualidad, retardar el endurecimiento del pan.
El pan blanco sin aditivos ,almacenado a temperatura ambiente, se endurece en dos días y medio. Aquí el comportamiento de amilasas de distintas fuentes es diferente. Las alfa-amilasas maltogénica y fúngica aumentan la vida media del pan a 5 días si bien el valor final de endurecimiento es el mismo. Sin embargo, la alfa amilasa de procedencia bacteriana no sólo hace que la vida media aumente sino que reduce a la mitad el valor final. Pero, si nos excedemos un poco en la utilización de alfa amilasa bacteriana, la textura de la miga de pan se vuelve gomosa después de uno o dos días en almacén. Existen dos explicaciones: La estabilidad termal de la bacteria permite a algunas enzimas sobrevivir al proceso de horneado y continuar hidrolizando el almidón durante el almacenaje y/o las dextrinas con grado de polimerización desde 25 a 35 formadas a partir de la alfa amilasa bacteriana son humectantes e inherentemente gomosas. Esto hace que se estén investigando otras carbohidrasas con el fin de conseguir un mejor control del endurecimiento del pan: amiloglucosidasa, amiloglucosidasa más alfa amilasa, pululanasa más alfa amilasa y exo-alfa amilasa. En las panaderías industriales de nuestra zona se está utilizando alfa amilasa producida por Bacillus subtilis modificada genéticamente por una cepa de Bacillus stearothermophilus, consiguiéndose con ello prolongar la vida comercial de los productos panificados sin producir un efecto gomoso ni afectar las propiedades de manipulación de la masa.
De lo anterior se deduce que es la alfa amilasa de origen fúngico la fundamen-talmente utilizada en la industria de la panadería, y es ella a la que nos referiremos en el resto de la exposición.
La alfa-amilasa fungal (1,4-a-glucan-glucanohidrolasa) es una glicoproteina de 478 aminoácidos.(2) Su estructura tridimensional posee tres dominios .Su conformación está estabilizada por cuatro puentes disulfuro. La presencia de calcio es necesaria para su actividad. Dos zonas de unión al calcio se localizan en lugares próximos a las zonas de actividad enzimática.( 3)
La alfa-amilasa contiene principalmente epitopos para células B, habiéndose demostrado que la digestión enzimática por tripsina y endoproteasa Arg-C no destruye su capacidad para unirse a IgE( 4). Baur ha demostrado que el componente que se une casi exclusivamente a la IgE de los asmáticos sensibilizados a este enzima corresponde a una banda de 53 kDa y de pI 4.0 en el SDS-PAGE e isoelectroenfoque respectivamente.
Dado que hasta ahora un alergeno de 18 kDa procedente del género Aspergillus ha sido caracterizado. y denominado Asp f I,Baur ha propuesto, siguiendo la nomenclatura de la International Union of Immunological Societies , que este importante alergeno sea denominado Asp o 2.(5)
Nuestra casuística de Asma ocupacional por sensibilización a alfa amilasa recoge quince pacientes. Se trata de 8 varones y 7 mujeres de edades comprendidas entre 27 y 57 años (media 33.5).La mayoría trabajadores de panaderías familiares ,de pequeño tamaño, por lo general mal ventiladas. y en muchas ocasiones contiguas al domicilio.
En todos ellos el diagnóstico se basó en una historia clínica compatible, prueba cutánea con alfa amilasa positiva (3+/4+),IgE específica (Pharmacia Cap System) positiva(igual o mayor a clase 2) y prueba de provocación bronquial específica positiva, presentando 14 pacientes un patrón de respuesta inmediata y 1 dual. La valoración del deterioro pulmonar, siguiendo los criterios de evaluación de la American Thoracic Society (1993) correspondían en el momento del diagnóstico en 14 casos ,uno de los cuales era el asma dual, a un grado I y en 1 caso a un grado II. .Al cabo de 3 años de seguimiento, y sin haber dejado el trabajo, persistían los mismos niveles de deterioro.(6)
Ninguno de estos pacientes refería tener problemas al ingerir pan u otros alimentos en cuya composición utilizaban alfa amilasa. Sin embargo. Kanny(7) describe el caso de una mujer afecta de asma del panadero que presentó una caida del PEFR del 21% tras provocación oral a doble ciego con alfa amilasa cocinada (100°C durante 30 minutos). Asi mismo Baur(8) publica un caso de asma del panadero que presentaba clínica exclusivamente nasal, y un aumento de las resistencias nasales por rinomanometría tras ingerir pan con a-amilasa. Este mismo autor se plantea si puede considerarse a la alfa amilasa un antígeno por vía digestiva: de once panaderos estudiados, tan sólo en uno encuentra una débil respuesta a la alfa amilasa calentada (200°C) por lo que deduce que el calor no inactiva de forma absoluta la capacidad de dicho enzima para fijar IgE.En dicho trabajo considera que son precisos más estudios para valorar la alergenicidad residual o aparición de nuevos determinantes trás el horneado. (9)
Ante la aparición de estas publicaciones sobre asmáticos sensibilizados a alfa amilasa que presentaban reacciones adversas tras comer pan decidimos estudiar que ocurría con este alergeno al ser sometido a las temperaturas de horneado.
Para ello obtuvimos la colaboración de 7 panaderos,5 varones y 2 mujeres de edades comprendidas entre 27 y 53 años (media 35 años), sensibilizados a alfa amilasa fúngica (procedente del Aspergillus oryzae).
­ Para preparar los extractos alergénicos utilizamos alfa amilasa procedente del Aspergillus oryzae (suministrada por Arkady ADM Ibérica, Barcelona) que se horneó a temperaturas de 100 y 200°C durante 20 minutos.Se prepararon tres muestras : alfa amilasa cruda (A) , alfa amilasa horneada a 100°C(B) y alfa amilasa horneada a 200°C (C). Se incubaron 5 g de cada una de ellas en 25 ml de PBS durante 18 horas. Se pasó por filtro de papel y posteriormente por filtro Millipore (0.22micras).La concentración final de los extractos fué de 2mg/ml.Se congelaron los extractos en alicuotas hasta el momento de realizar los estudios.
Las pruebas cutáneas se realizaron en la superficie anterior del antebrazo según metodología de prick y por triplicado. Se usaron lancetas Dome-Hollister. La medida de la pápula obtenida se calculó hallando la media de la suma aritmética del diámetro mayor y el perpendicular al mismo expresándolo en mm. Los resultados se valoraron respecto a los controles de histamina (10 mg/ml) y PBS .
Realizamos SDS-PAGE y SDS-PAGE-Immunoblotting (10) con los tres extractos y los sueros de los 7 pacientes.Los resultados de dichos estudios se detallan a continuación:
En los siete pacientes las pruebas cutáneas con el extracto crudo (A) resultaron positivas. Esta positividad persistió en todos ellos al ensayar el extracto B (alfa amilasa horneada a 100°C), si bien en cuatro sujetos se objetivó una disminución de la pápula obtenida con la alfa amilasa horneada. Por el contrario ,en todos ellos las pruebas realizadas con el extracto C (horneado a 200°C) resultaron negativas.

SDS-PAGE

La muestra de alfa amilasa cruda(A) sometida a una electroforesis en presencia de SDS mostró una banda proteica principal de 48,3 kDa que representaba un 95% en peso de la muestra. 
La muestra de alfa amilasa horneada a 100°C(B) tras electroforesis en presencia de SDS, mostró una sola banda proteica de 50 kDa que representaba un 100% en peso de la muestra. En el estudio de la muestra C, obtenida a partir de alfa amilasa horneada a 200°C, no se obtuvo banda proteica alguna.

SDS-PAGE-Immunoblotting:

Se realizó un ensayo de SDS-PAGE Immunoblotting con las 3 muestras de alfa amilasa, incubándolas con el suero de los pacientes. Las IgEs presentes en el suero de los pacientes se fijaron a la proteina de 48,3 kDa y 50 kDa en las muestras A y B respectivamente, mientras que en el ensayo realizado con la muestra C no se observó fijación de IgE a la membrana.
Aún tratándose de pocos casos, en nuestro estudio parece quedar demostrado que una vez sometido dicho enzima a las temperaturas habituales de horneado ,la actividad alergénica desaparece tal y como queda reflejado en los test cutáneos. Es más, tal y como se muestra en el SDS-PAGE la proteína se degrada completamente, reduciéndose probablemente a péptidos muy pequeños que no manifiestan carácter alergénico alguno.
Como resumen final podemos concluir que: 1. El alergeno dominante del enzima alfa amilasa es una glicoproteina de unos 50 kDa de peso molecular. 2. Su denominación es Asp o 2. 3. Contiene principalmente epitopos para células B. 4. El enzima a-amilasa no parece ser un alergeno de interés por vía digestiva ,una vez sometido a las temperaturas de horneado.

BIBLIOGRAFIA

1. Stauffer, C.; La utilización de enzimas en productos de panadería. Boletín técnico. Ed:Gur Ranhotra.1994;16:1-11.
2. Toda, H.; Kondo, K.; Narita, K. The comnplete amino acid sequence of taka-amylas A. Proc Japan Acad 1982;58:208-212.
3. Swift, H.J.; Brady, L.; Erewenda, Z.S.; Dodson, E.J.; Turkenburg, J.P.; 
Wilkinson, A.J. Structure and molecular model refinement of Aspergillus orizae (TAKA) alpha-amylase:an application of the simulated-annealing method. Act Crystallogr-B.1991 Aug 1,47(Pt4):553-44
4. Sander, I.; Baur, X. Evidence for continuous B-cell epitopes on a-_amylase of Aspergillus oryzae (Asp o 2). J. Allergy Clin Immunol 1994;93:265.
5. Baur, X.; Chen, Z.; Sander, I. Isolation and denomination of an important allergen in baking additives: a- amylase from Aspergillus oryzae (Asp o II). Clin Exp Allergy. 1994; 24:465 - 470.
6. Alonso, L.; Blanco, J.; Juste, S.; Garcés, M.; Pérez, R.; Marcos, M.; 
Carretero, P. Evaluation of impairment in patients with occupational asthma caused by a-amylase.Allergy 1995; 50 :172
7. Kanny, G.; Moneret-Vautrin, D.A. Alpha amylase contained in bread can induce food allergy. J Allergy Clin Immunol 1995;95:132 ­ 133.
8. Baur, X.; Czuppon, A.B. Allergic reaction after eating alpha-amylase (Aso o 2)-containing bread. Allergy 1995;50: 85 ­ 87.
9. Baur, X.; Sander, I.; Jansen, A.; Czuppon, A.B. Sind Amylasen (Backmittelenzyme) relevante Nathruntgsmittelallergene? Schweiz Med Wochenschr 1994;124:846 ­ 851.
10. Blanco Camona, J.; Alonso Gil, L.; Bartolomé Zavala, B.; Vallverdú, A.; Palacios, R.; Juste Picón, S.; Garcés Sotillos, M.; Garcia Gonzales, F.; Perez Giménez, R. Asma por sensibilización a alfa amilasa.?Es este enzima un alergeno de interés por via digestiva?
11. Rev. Esp. Alergol. Inmunol Clin. 1997;12:288-292.