ALERGIA A LOS INHIBIDORES DE a-AMILASA DE CEREALES

Dra. Alicia Armentia.
Sección Alergología. Hospital Río Hortega. Valladolid.

Los granos de cereales incluyen el trigo, maíz, arroz, cebada, sorgo, avena, mijo y centeno. Todos estos granos, colectivamente, representan el 72% de las proteinas de la alimentación mundial.
El trigo, la cebada y el centeno son especies de gramíneas estrechamente relacionadas pertenecientes a la tribu Triticeae. En la composición de sus semillas intervienen diferentes clases de proteínas: las solubles en agua o álbúminas, las globulinas, solubles en sal, las prolaminas, solubles en alcohol y agua y las insolubles gluteninas (1-4). Las proteínas solubles constituyen el 25% de las proteínas de las semillas y numerosos estudios han confirmado su importancia en las respuestas mediadas por IgE, tanto por su papel en la dermatitis atópica (13) como en la sensibilización inhalatoria (5-12). Esta última, conocida globalmente como enfermedad del panadero, además de su gravedad y difícil tratamiento cuando el paciente no puede evitar su inhalación, es una enfermedad que ocasiona importantes problemas legales y económicos (11).
Los trabajadores cerealistas (agricultores, molineros, empaquetadores de piensos) y los que trabajan en el ambiente panadero y confitero están sometidos a multitud de estímulos antigénicos (2-4). En nuestra zona, en la mayoría de los casos trabajan en pequeñas factorías familiares o en silos y graneros con pésimas condiciones de aireación. Aunque conocen la utilidad de las medidas de protección personal, no las suelen usar por las molestias que provocan en un ambiente donde han de soportar grandes temperaturas y esfuerzos. En el caso de los mejorantes como la a-amilasa se están utilizando cada vez mas los preparados sólidos en vez de polvo, que provocan una menor dispersión de partículas. Pero en el caso de las harinas esto no es posible. Debido a la gran prevalencia de este tipo de asma en nuestra región (el 25% de los pacientes expuestos padecen asma profesional), venimos intentando desde hace años aislar, purificar y evaluar la alergenicidad de los cereales en la búsqueda de un posible control ambiental y terapéutico de esta enfermedad ( 5-18). 
Debemos considerar que la harina es un ecosistema complejo en el que entran a formar parte elementos vegetales: pólenes de cereales, proteínas del endospermo del grano, esporas y hongos, distintos aditivos como la a-amilasa (2) y alergenos de artrópodos como parásitos del grano, cucarachas y ácaros (principalmente de almacenamiento) que son considerados a su vez potentes alergenos (19, 20). (Recientemente, han sido descritos cuadros de asma por la ingesta de cereales contaminados por ácaros de almacenamiento (21). ¿Cómo identificar los alergenos causantes de la clínica alérgica? 
Las técnicas electroforéticas para aislamiento de proteinas son superiores a otros métodos como la cromatografía porque tienen mas resolución y son capaces de resolver la compleja composición proteica de la harina en orden a caracterizar sus posibles alergenos (2). Posch y cols. (Electrophoresis 1995; 16:1115-19) y Weiss y cols. (Electrophoresis 1993;14:804-816), utilizando electroforesis bidimensional de alta resolución en combinación con análisis de proteinas detectaron alrededor de 700 proteinas solubles en trigo, de las cuales 70 detectaban IgE, sobre todo las localizadas en las areas de 14-18, 27, 37, 55 y 70 Kda. Mediante secuenciación de aminoácidos encontraron homologías en proteasas inhibidoras de a-amilasa (14-18 Kda), acil-CoA oxidasa (26 Kda) y fructosa-bifosfato aldolasa (37 Kda) de trigo, maiz y cebada (figura 1). Sin embargo estos interesantes estudios no aclaran totalmente qué proteínas pueden ser clinicamente relevantes. Por ello intentamos aislarlas para una vez purificadas y aisladas en extractos diagnósticos pudiéramos comprobar su reactividad "in vivo". 
Para ello primero utilizamos un pool de 35 sueros procedentes de pacientes con asma del panadero, con RAST clase 4 a harina de trigo y cebada . Nuestros primeros resultados nos permitieron constatar que los alergenos mas reactivos eran proteínas solubles en sal, de 12-15 Kda, pertenecientes a una única familia que incluye varios inhibidores de alfa amilasa heterólogos, con un alto grado de presencia en los cereales y con una potencial participación en los mecanismos de defensa de los mismos contra las plagas de almacén que los infestan (14). Así, el alergeno mayor de la cebada era capaz de inhibir la a-amilasa del Tenebrio mollitor , parásito habitual de este cereal (6). Muchos miembros de esta familia inhibidora fueron reconocidos por la IgE específica de nuestros pacientes, sin embargo, tenían muy diferente capacidad alergénica. En la figura 2 podemos ver una electroforesis bidimensional y cromatograma del fraccionamiento por cromatografía reversa líquida de alto grado de resolución (HPLC) del inhibidor tetramérico del trigo. Intentamos llamar la atención sobre la posición de la proteína más reactiva (CM16*) marcada con una flecha en el mapa bidimensional y en el perfil de elución. Las proteinas CM16 y CM16* presentaban el mismo Pm pero un comportamiento diferente en el immunobloting al enfrentarlas a sueros de pacientes reactivos. Lo mismo ocurría con el componente CMb y CMb* de la cebada. Tras sucesivos intentos de encontrar qué es lo que diferenciaba a estas proteínas desde el punto de vista de su alergenicidad (secuenciación de aminoácidos, excisión de péptidos, tests de detección de glicanos) se demostró que lo que hacía reactivas a estas proteinas era la unión a glicanos complejos xilosa y fucosa, y que estos glicanos se comportaban como epitopos fijadores de IgE (9). Esto explicaba el por qué los pacientes cerealistas o panaderos que reaccionaban mayormente a proteinas purificadas glicosiladas de cebada o trigo, siendo la prueba cutanea con extracto comercial de cereal y el RAST negativos. Sin embargo, la provocación inhalativa con estas proteinas purificadas eran positivas, lo que demostraba su importancia como agente etiológico del asma ocupacional (22). Recientemente hemos demostrado que los glicanos complejos de otros invertebrados y plantas tienen epitopos similares (9). De esta forma los anticuerpos IgE de nuestros panaderos eran capaces de reconocer glicoproteínas de coleópteros, leguminosas, y curiosamente de veneno de abeja (figura 3). Esto podría explicar el curioso hallazgo de casos de anafilaxia tras la primera picadura de estos himenópteros, sin periodo previo de latencia o sensibilización. En el mismo contexto, la a-amilasa de Aspergillus orizae Asp o 2 es también una glicoproteina con 478 aminoácidos y tres dominios estructurales (figura 4).
Recientes estudios de Sandiford y cols. (12) han mostrado que las personas sensibilizadas a proteínas solubles de trigo son capaces de producir IgE específica también a las proteínas insolubles. Sus experiencias con western blotting han llevado a la conclusión de que las gliadinas y gluteninas con similar peso molecular que los inhibidores enzimáticos endógenos son también alergenos importantes (al parecer, por compartir epítopos inter-reactivos con estas proteínas solubles), por lo que podrían también producir asma. Estos resultados sugieren que el número de alergenos involucrados en el desarrollo de hipersensibilidad a cereales es mayor que el que previamente se pensaba.
De todas formas, las albúminas y globulinas del grano de cereal parecen ser las proteínas más importantes cuando se desencadenan reacciones de hipersensibilidad inmediata (2-5). Diferentes investigadores han confirmado la presencia de IgE específica a albúminas y globulinas en el suero de niños con alergia alimentaria a cereales y con asma del panadero, pero no en los pacientes con celiaca (3-22). Sin embargo, mientras que la sensibilización inhalatoria a harina de cereales es una de las formas de alergia ocupacional más estudiada, existen pocos estudios sobre los alergenos específicos responsables de reacciones alérgicas tras la ingesta de estas proteínas (23). Recientemente, hemos podido comprobar que pacientes con síntomas alérgicos tras la ingesta de Coca-Cola y Cola-Cao pueden estar sensibilizados a cereales, principalmente a proteinas de centeno en los casos de asma y a cebada en los de anafilaxia (24).
En resumen, creemos que el estudio de la alergenicidad de las proteínas de cereales puede ser muy útil y su utilidad se fundamenta en que el asma del panadero es la patología respiratoria ocupacional mas prevalente en muchos paises. Según Baur (25), en Alemania 1800 panaderos reclaman anualmente compensaciones por esta enfermedad. En su serie sobre 405 panaderos un 60% presentaban sensibilización a harina de trigo, un 57% a centeno y un 22 % a a-amilasa (Asp o 2). Entre los alergenos purificados causantes del asma del panadero destacan varias proteínas solubles en sal como alergenos principales: proceden del endosperma del grano de cereal, poseen pesos moleculares comprendidos entre 12 y 15 Kda y pertenecen a una misma familia de inhibidores de a-amilasa y tripsina (1, 5-10). ( Ver tabla I ).
Estas proteínas parecen estar involucradas en mecanismos de defensa de las plantas mediante la inhibición de las a-amilasas digestivas de diferentes parásitos, impidiendo así su degradación. Acorde con esta consideración se encuentran diversas observaciones, unas tomadas del estudio de plagas y otras del estudio de especificidades de los inhibidores frente a enzimas de diferentes insectos: Los insectos que se alimentan del endosperma del trigo poseen unos niveles muy altos de a-amilasa (26,27); el alergeno mayor de la cebada es un inhibidor específico de la a-amilasa del Tenebrio mollitor, parásito habitual de este cereal (6); mientras los inhibidores del centeno restringen su actividad hacia Omoplus lepturoides y no presentan actividad alguna frente a Tenebrio mollitor.
Tras la caracterización, aislamiento y purificación de los inhibidores de a-amilasa del trigo que originan la enfermedad del panadero, nuestro análisis del papel alergénico de proteínas de determinados alimentos (Coca-Cola, Cola-Cao y ciertos cafés solubles malteados) en alérgicos a cereales por vía digestiva nos ha llevado a mostrar su utilidad en el diagnóstico de alergia encubierta a cereales, con lo que se concluye que una misma proteína puede ser reactiva por ambas vías de sensibilización. Estos hallazgos, junto con los ya mencionados de Sandiford (12) y Baur (25), permitirían definir el comportamiento general como una expresión de multigénica de la familia de inhibidores de a-amilasa en diferentes cereales. De este modo, las especies de la tribu Triticeae se pueden considerar como diferentes manifestaciones de un genoma similar, y la sensibilización a sus diferentes proteínas podría explicar la variabilidad en los hallazgos clínicos y en la respuesta terapéutica de pacientes con sensibilización a diferentes harinas de cereales (26). 
Finalmente, como aplicación de los resultados de nuestro estudio y de los autores citados, es posible ofrecer las siguientes sugerencias de aplicación clínica:
La purificación y aislamiento óptimos de los alergenos mayores para su utilización en tests in vivo e in vitro puede ser de gran importancia en el diagnóstico de estas enfermedades.
El conocimiento de estas proteínas y su actividad biológica en el ser humano podrían ser base de la manipulación genética de las plantas para cultivos de especies menos alergénicas y también mas resistentes a plagas.
La disminución de la alergenicidad de las plantas mediante manipulación genética podría lograr la síntesis de fármacos menos sensibilizantes, lo cual constituye una seria limitación de la biotecnología con plantas en la actualidad.

Agradecimientos

A los Drs. Rosa Sanchez Monge, Gloria García Casado y Gabriel Salcedo por haberme dado la oportunidad de trabajar con ellos, excelentes personas en el nivel científico y humano. A todos los miembros de la Secciones de Alergia y Bioquímica del Hospital Universitario "Del Río Hortega" por la misma razón.

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