TERCERA PONENCIA:
AVANCES EN EL DIAGNÓSTICO ALERGOLÓGICO
Primera Parte: Técnicas
"in vitro".
La citometría de flujo en el diagnóstico alergológico
MODERADOR:
Dr. Carlos Lahoz.
Jefe del Servicio de Inmunología.
Hospital "Fundación Jiménez Díaz". Madrid.
INTRODUCCIÓN A LA CITOMETRÍA DE FLUJO.
CONCEPTOS BÁSICOS
Y APLICACIONES DIAGNÓSTICAS.
Ignacio J. Ansotegui *, M. Luisa Sanz**, Carlos Lahoz*** .
*Servicio de Alergia e Inmunología, Hospital Santiago Apóstol, Vitoria-Gasteiz
**Servicio de Alergología e Inmunología, Clínica Universitaria de Navarra, Pamplona
***Servicio de Inmunología, Fundación Jiménez Díaz, Madrid
INTRODUCCIÓN
Con la aparición de los anticuerpos monoclonales a finales de los setenta y su ulterior desarrollo en las décadas siguientes, se produce un mayor conocimiento de las características moleculares y antigénicas de las células. Asimismo, las técnicas de inmunofluorescencia que se venían realizando con sueros policlonales pasan a ser más especificas con el uso de los anticuerpos monoclonales.
En la inmunofluorescencia directa, un anticuerpo conjugado con un fluorocromo se une directamente a un antígeno celular y marca específicamente a la célula portadora de dicho antígeno. En la inmunofluorescencia indirecta, un segundo anticuerpo especie-específico, conjugado con un fluorocromo, se une al primer anticuerpo previamente fijado sobre el antígeno. Con esta técnica, generalmente se obtiene una mayor intensidad de fluorescencia ya que al primer anticuerpo se le unen más de un segundo Ac, produciendo un efecto de amplificación. Para evitar uniones inespecíficas a los receptores Fc de los linfocitos es preferible utilizar fragmentos F(ab)2, obtenidos por digestión con pepsina de los anticuerpos.
Como todo inicio, el boom de los anticuerpos monoclonales trajo con sí un cierto caos, al menos, desde el punto de vista de la denominación de los mismos. Con el objeto de establecer una normativa de identificación, nomenclatura y caracterización de las estructuras moleculares que se expresan en la superficie celular, desde el año 1980 se vienen realizando
"Workshops" y publicaciones "Leucocyte typing" que establecen los criterios que definen los CD.
"Cluster Differentiation antigen" o CD se define como la estructura antigénica expresada en la superficie celular, caracterizada por ser reconocida por, al menos, dos anticuerpos monoclonales diferentes y tener definido el peso molecular. Cada uno de los antígenos individualizados se denominan CD seguido de un número de identificación. Cuando existen dudas sobre la identidad de un nuevo CD, el número de identificación va precedido de la letra W.
Una vez definidas las estructuras moleculares expresadas en cada tipo celular, a veces, dependiendo de su estado de activación, así como de los anticuerpos específicos para su reconocimiento, surgen ensayos y proyectos para estudiar el grado de correlación entre las diferentes estructuras conocidas. Por ejemplo, se sabe que las células productoras de inmunoglobulinas presentan en su superficie un solo tipo de cadena ligera (k o l). Por tanto si utilizamos anticuerpos anti-k o anti-l conjugados con fluorocromos diferentes podremos diferenciar los dos tipos de linfocitos B.
Otras veces, los antígenos no son excluyentes entre sí y se expresan en una misma célula, lo que obliga a realizar los experimentos en pasos separados o usar filtros ópticos que permitan la identificación correcta de los diferentes fluorocromos.
En muchos casos las diferencias de señal fluorescente no son cualitativas sino cuantitativas, y la información la obtenemos valorando la intensidad de fluorescencia. Cuando las diferencias son claras no hay problema en la correcta interpretación de los resultados, pero con frecuencia las diferencias son escasamente apreciables por el ojo humano.
Es por esto que la interpretación de la fluorescencia requiere objetividad, sensibilidad, precisión, reproducibilidad y el análisis de una cantidad suficiente de células. El sistema que cumple con estos requisitos y además emplea poco tiempo, es la citometría de flujo.
CITOMETRÍA DE FLUJO
La citometría de flujo consiste en la medición de las propiedades físico-químicas de células o partículas en suspensión a través de un flujo laminar y una fuente de luz (láser).
FLUIDOS
Las células han de encontrarse en suspensión para ser captadas por el sistema de fluidos del citometro de flujo. Cuando las condiciones son adecuadas, la muestra fluye en un núcleo central sin mezclarse con el líquido de arrastre. Este fenómeno se denomina Flujo Laminar. El lugar donde tiene el encuentro entre las células en flujo laminar y el haz de luz láser es la cámara de flujo.
Las células que vienen en pequeños grupos traídas por el líquido de arrastre, se disponen en línea dentro de la cámara de flujo para poder ser analizadas individualmente. Es la adecuada presión de la muestra dentro de la cámara de flujo la que permite la correcta disposición en línea de las células y así centrarlas en el haz de luz láser. Por tanto la cámara de flujo es quien define las características del flujo, el enfoque hidrodinámico y es el lugar donde se produce la intercepción entre el haz focalizado del láser y la muestra, en el llamado punto de interrogación.
ÓPTICA
Las fuentes de luz láser utilizadas en citometría de flujo pueden diferenciarse por su sistema de refrigeración: Aire o Agua (más costoso) o por su potencia: Baja (utilizados en citometros de rutina) y Alta (citometros con función de separación celular sorting). El láser más extendido en citometría es el de Argón que emite a 488 nm, refrigerado por aire y de baja potencia (15mW)
Forward Scatter (TAMAQO CELULAR)
Cuando el haz de luz impacta con la célula en la cámara de flujo, provoca una dispersión de la luz frontal. Esta luz frontal dispersada y refractada nos da información proporcional al tamaño celular.
Side Scatter (COMPLEJIDAD ESTRUCTURAL)
Cuando el haz de luz impacta con la célula en la cámara de flujo, también provoca una dispersión lateral de la luz a 90: y nos informa sobre la estructura celular interna o complejidad estructural. Así, los linfocitos pobres en estructuras granulares dan una señal menor que los polimorfonucleares (PMNs) ricos en gránulos y con mayor complejidad estructural.
Gracias a la información de tamaño celular y complejidad estructural, confrontando ambos parámetros en un Dot plot, podemos identificar claramente tres grupos de poblaciones celulares: Una de pequeño tamaño y baja complejidad que corresponde a los linfocitos; otra de mayor tamaño y complejidad correspondiente a los monocitos; y una tercera de tamaño similar o ligeramente mayor que los monocitos pero con mucha mayor complejidad estructural que identifica los polimorfonucleares.
Canales de fluorescencia (FL1, FL2, FL3...)
El citometro, además del tamaño y la complejidad, nos mide la cantidad de fluorescencia emitida por la luz dispersada a 90: tras el impacto del haz láser con la célula en la cámara de flujo. La fluorescencia emitida por cada fluorocromo o colorante debido a la excitación del láser es normalmente detectada por un único canal de fluorescencia. La especificidad de la detección está controlada por la selección de longitudes de onda por parte de espejos y filtros ópticos del citometro.
Los filtros ópticos están construidos a partir de materiales que absorben o reflejan ciertas longitudes de onda, se usan para eliminar y separar la luz recogida y deben tener:
alta transmitancia dentro de su banda de paso
banda de paso limitada y estrecha
baja autofluorescencia
buena estabilidad y resistencia a la luz.
Hay varios tipos de filtros:
Absorción: Absorben la luz no deseada (pueden dar problemas de autofluorescencia).
Interferencia: Atenúan o reflejan la luz no deseada.
Los fluorocromos para anticuerpos más utilizados son el Isotiocianato de Fluoresceina (FITC) que emite a 525 nm, R-Phycoerythrin (PE) cuya emisión es de 578 nm y el Peridinin Chlorophyll Protein (PerCP) que emíte a una longitud de onda 675 nm. También hay fluorocromos para marcar DNA entre los que destacan el Hoechst 33342 (483 nm), la Rhodamina 123 (525 nm) y el Ioduro de propidio (617 nm)
Dependiendo del citometro de flujo, de la cantidad de fuentes láser y de los fluorocromos se pueden leer simultáneamente 2, 3 ó más fluorescencias en un misma célula.
Tan importante como los fluidos y la óptica en un citometro de flujo es la electrónica y sus detectores de señal, como fotodiodos y fotomultiplicadores que convierten la señal luminosa en impulsos eléctricos. Los fotodiodos capturan la señal de dispersión frontal (FSC) mientras que los fotomultiplicadores (PMT) tienen gran sensibilidad y recogen la débiles señales de dispersión lateral (side scatter) y de fluorescencia. Regulando los fotomultiplicadores podemos compensar el instrumento, evitando señales confusas de fluorescencia, cuando ambas ondas de emisión se sobreponen parcialmente.
Sistema informático
Gracias a la informática podemos establecer criterios de selección para estudiar las distintas inmunofluorescencias. Así por ejemplo, en una muestra de leucocitos, podemos seleccionar por separado los datos de los linfocitos, de los monocitos y de los PMNs. También podemos seleccionar por criterios de fluorescencia y por ejemplo, recabar información del número de células CD4 + que a su vez sean exclusivamente CD3+. Estos criterios de selección se denominan gates y se pueden realizar tanto a la hora de adquirir como a la de analizar La informática nos permite estudiar y presentar los datos como histogramas, plots de puntos, plots de densidad, plots de contorno, representaciones tanto 2D como 3D, etc.
Aplicaciones más comunes de la citometría de flujo
En la práctica médica las aplicaciones más comunes de la citometría de flujo son
Estudio de poblaciones leucocitarias en sangre y BAL
Estudios de proliferación celular
Determinación de citocinas y moléculas intracelulares
HLA-B27
Estudios de fagocitosis
Déficits celulares y moleculares
Estudios de activación celular
Estudio de poblaciones leucocitarias
Las poblaciones linfocitarias básicas son
Linfocitos T helper CD3+CD4+
Linfocitos T citotóxicos CD3+CD8+
Linfocitos B CD19+
Linfocitos NK CD3- CD16+ CD56+
Para el estudio de las poblaciones linfocitarias el primer paso fundamental es la correcta selección de los linfocitos, bien por sus peculariedades de tamaño y complejidad estructural o bien por su alta positividad para el marcador panleucocitario CD45 y negatividad para un marcador de monocitos como el CD14. Este problema se pude obviar purificando previamente los linfocitos, pero es un proceso costoso en tiempo y material que no se emplea en la rutina de las poblaciones linfocitarias.
Poblaciones leucocitarias en BAL
Por medio de los anticuerpos monoclonales anti-HLA-DR y anti CD15 podemos separar las distintas poblaciones en el lavado broncoalveolar (BAL).
Estudios de proliferación celular
Gracias a los marcadores fluoresecentes que se incorporan en las células vivas sin interferir en sus funciones celulares como el
"linker" PKH26, podemos determinar el grado de proliferación celular, tras un fenómeno de activación, tanto del conjunto linfocitario como de las distintas poblaciones reconocidas por medio de anticuerpos monoclonales conjugados con otros fluorocromos. Estos estudios nos dan la idea del grado de respuesta del sistema inmunológico.
Determinación de citocinas y moléculas intracelulares
Las moléculas intracelulares también pueden ser reconocidas por anticuerpos monoclonales, pero como éstos no son capaces de atravesar la membrana celular, la célula debe ser fijada y después permeabilizada para permitir la entrada de los anticuerpos. Uno de los pasos más delicados es la elección del fijador que debe cumplir los siguientes requisitos:
Que penetre lo más rápidamente posible en las células
Que acceda por igual a todos los compartimentos celulares
Que preserve la estructura celular y la antigenicidad
Que permita la interacción de los anticuerpos con los antígenos celulares
Que no aumente la autofluorescencia
Los fijadores más utilizados son el formaldehido al 1% y el paraformaldehido al 4%. Una vez bien fijada la célula se procede a su permeabilización con disolventes, detergentes o Lisolecitina (lisofosfatidil colina) que reemplaza los fosfolípidos de la bicapa lipídica de la membrana plasmática respetando la configuración espacial que ésta posee.
Determinación de citocinas intracelulares
El primer paso consiste en estimular la producción de citocinas activando las células por cross-linking de CD28 con CD3, usando lectinas mitogénicas, empleando ionóforos del calcio, utilizando LPS, superantígenos o respuestas antígeno específicas. Además se pueden utilizar sustancias bloqueantes del aparato de Golgi o del RER para que las citocinas se acumulen en estas localizaciones.
Antes de proceder al marcaje de la superficie celular con anticuerpos monoclonales conjugados con fluorocromos, usaremos anticuerpos anti-Fc que bloqueen los receptores Fc e impidan una unión no específica de nuestros anticuerpos.
Tras la fijación y permeabilización de las células, como se ha explicado anteriormente, se procede al marcaje de las citocinas intracelulares con anticuerpos monoclonales específicos conjugados con otros colores diferentes al usado en el marcaje de la superficie celular.
Teniendo en cuenta las correctas diluciones de los anticuerpos, o bien realizando pretratamientos con anticuerpos bloqueantes o con citocinas recombinantes que nos ayudan a conseguir el equilibrio óptimo entre señal y ruido de fondo. Podemos pasar al análisis citométrico donde determinaremos el perfil de citocinas de cada célula.
Citocinas intracelulares
Producción de IFN-g e IL-4 en linfocitos activados (CD69+) con el antígeno mayor de la olea.
Cambios en la intensidad de fluorescencia
La interpretación de muchas de las aplicaciones de la citometría de flujo son a través de los datos constitutivos de la intensidad de fluorescencia como en la determinación de HLA-B27, o a través de cambios en la intensidad de fluorescencia, bien sean producidos, tras estimulación, por la inducción de la expresión de nuevas moléculas o por cambios conformacionales de las mismas. Así ocurre con técnicas como el estudio de la fagocitosis, la determinación de algunos déficits funcionales y sobre todo en los estudios de activación celular, tales como los cambios observados en el CD63 de los basófilos tras estimulación antigeno específica. En este sentido hemos podido comprobar la eficacia de esta técnica en el diagnóstico de algunas enfermedades alérgicas tales como las producidas por inhalantes, alimentos, látex y antibióticos betalactámicos donde esta técnica demuestra tener una sensibilidad superior a las técnicas convencionales, tales como la determinación de IgE específica y se ofrece como una herramienta de diagnóstico in vitro con un gran futuro.
Conclusiones
La citometría de flujo es una herramienta que nos permite identificar y caracterizar estructuras y funciones celulares con:
Objetividad
Sensibilidad
Precisión
Reproducibilidad
Análisis de un gran número células en poco tiempo
Información del volumen celular (Forward scatter), de la complejidad celular (Side scatter) y de la intensidad de fluorescencia de cada célula
Valoración simultánea de varias fluorescencias
Posibilidad de estudio y análisis de los datos incluyendo criterios de selección.