TEST DE ACTIVACIÓN DE LOS BASÓFILOS EN EL DIAGNÓSTICO IN VITRO DE LAS ENFERMEDADES ALÉRGICAS

María L Sanz, Carina Uasuf, Germán Sánchez, Pedro M Gamboa*
Departamento de Alergología e Inmunología Clínica
Clínica Universitaria de Navarra. Pamplona
* Hospital Basurto. Bilbao

Introducción

El diagnóstico in vitro de las enfermedades alérgicas constituye un reto importante, especialmente en aquellos casos en que la clínica o las pruebas in vivo son peligrosas, cuestionables o no definitivas.
El estudio in vitro de las reacciones alérgicas frente a algunos alergenos tales como los inhalantes no ofrece problemas importantes, ya que en su mayoría son Ag bien estandarizados, con capacidad de activar una respuesta IgE mediada, de manera tal que la determinación de IgE específica se convierte en la prueba in vitro gold estándar para el diagnóstico y la evaluación del grado de sensibilización del enfermo. Sin embargo, existen determinados alergenos (alimentos y medicamentos), cuyos resultados en las pruebas in vitro no son en general tan concluyentes, en especial con los medicamentos.
La búsqueda de pruebas in vitro capaces de detectar sensibilizaciones frente a alergenos de difícil diagnóstico nos ha llevado a lo largo de los años a probar tecnologías diferentes a la determinación de IgE específica.
Los fundamentos del test de activación de basófilos (TAB) fueron descritos hace algunos años por Gane P y cols (1,2), Knol EF y cols (3) y posteriormente Sabbah y Saint Laudy (4,5), utilizándolo en el diagnóstico alergológico in vitro de sensibilizaciones alérgicas frente a diferentes alergenos (6-8). Dicha técnica consiste en un ensayo de estimulación de basófilos in vitro con los alergenos problema, para su estudio posterior mediante citometría de flujo. Se utilizan dos anticuerpos monoclonales: Una anti-IgE marcada con FITC frente a receptores de alta afinidad de la membrana plasmática (marcador de basófilos), y anti-CD 63 marcado con PE (marcador de basófilos activados).
La molécula CD63 se expresa también en la membrana de algunas otras células como monocitos, macrófagos y plaquetas (9,10,11). Se ha podido demostrar que cuando los basófilos humanos son activados por el antígeno in vitro a través de los receptores de alta afinidad para la IgE ,expresan esta molécula sobre su membrana (12) y puede ser detectada mediante citometría de flujo (6).
Resultados obtenidos por dicha técnica han sido publicados en el diagnóstico de reacciones alérgicas a miorrelajantes (13), venenos (7), otros alergenos inhalados(14), alimentos (15) o alergia al látex (5). Exceptuando el trabajo de Abuaf y cols (13), el resto de las series adolecen de escasez en el número de casos, o de poca homogeneidad en las muestras o de falta de controles negativos (16).
En primer lugar, el objetivo de nuestro estudio fue estandarizar la técnica para alergenos ya caracterizados, tales como Dermatophagoides pteronyssinus y Lolium perenne. Segundo, estudiar la sensibilidad y especificidad de la técnica. Tercero, establecer los puntos de corte de positividad. Cuarto, analizar la fiabilidad de la técnica para alergenos peor caracterizados o de mayor dificultad en el diagnóstico in vitro de las reacciones alérgicas, tales como alimentarios o medicamentos.

Técnica

La citometría de flujo es una técnica analítica adecuada para detectar basófilos activados (marcados con anticuerpos monoclonales) cuantificando la fluorescencia emitida por estos.
Utilizamos un doble marcaje con Ac monoclonales: Con anti-IgE FITC nos permite seleccionar la población de basófilos que expresan receptores de alta afinidad para la IgE y de éstos, los que están activados con anti CD63 PE.
Nosotros hemos introducido algunas modificaciones a la técnica de Sainte-Laudy (4,16), tales como el uso de alergenos en fase líquida de uso corriente, cuyas diluciones de trabajo han sido recientemente preparadas, el uso de alergenos estandarizados procedentes de laboratorios Bial Aristegui y ajustando la primera fase de la técnica a la utilizada por el CAST de B|lhmann s, Lolium perenne (Bial Aristegui, Bilbao, a concentraciones10 y 100 ng/ml) o benzilpenicilina, ampicilina, amoxicilina, MDM, PPL, alimentos u otros alergenos, según el caso.
En paralelo, medimos la respuesta basal (control negativo) y la respuesta a Anti-IgE a una concentración de 1 ng/ml (control positivo) 
Tras marcar las células con los Ac monoclonales correspondientes se procede a analizar en el citómetro (488 nm argon-ion laser, FACScan, CellQuest software) las muestras problemas.
Realizamos una primera selección alrededor de los linfocitos, en relación al side-scatter y Forward-scatter. Posteriormente realizamos una segunda selección o "gate" de aquellas células (entre las seleccionadas previamente) que expresan receptores de alta afinidad para la IgE. Luego calculamos el porcentaje de basófilos que expresan en su membrana CD63, sobre el total de los mismos.
El número de basófilos con el que trabajamos es igual o superior a 500, lo que nos da una fiabilidad adecuada.

Alergia a inhalantes

1. Dermatophagoides pteronyssinus y Lolium perenne
En nuestro departamento, se realizó un estudio alergológico en 54 pacientes sensibilizados a Der p y 51 pacientes sensibilizados a Lolium perenne con historia compatible con rinitis, asma o ambas. Se llevaron a cabo los siguientes tests: pruebas cutáneas, IgE específica sérica frente a dichos alergenos, liberación de histamina, determinación de sulfidoleucotrienos y TAB. Como control se utilizaron 2 grupos: a) 24 pacientes atópicos con IgE sérica total mayor de 100 Ul/l y b) 35 pacientes sanos.
Obtuvimos entre otros, los siguientes resultados: 
­ No hubo diferencias significativas en la activación basal (sin estímulo Ag) entre los grupos de control y pacientes, siendo la activación basal media del grupo de controles atópicos 2.75 1 13.28%, la del grupo de controles sanos 0.9% 1 1.83 y la de los pacientes alérgicos a Der p 0,612,5% y a Lol p 317,55%
­ Encontramos una activación significativa del porcentaje de basófilos activados que expresan CD63 en respuesta al Ag con respecto a la basal tanto en pacientes sensibilizados a Dermatophagoides pteronyssinus (67.56% 1 26.3) como en pacientes sensibilizados a Lolium perenne (71% 1 37.9), con diferencias significativas respecto a ambos grupos control (p<0.001) 
­ La mediana del porcentaje de basófilos activados, tras estímulo Ag-específico (detectados mediante expresión de CD63) para inhalantes fue elevada (entre 67,56+ 26.3% para Der p y 71+ 37.9 % para Lol p), con cifras superiores a las obtenidas por otros autores (7).
­ Se obtuvo una correlación significativa entre TAB y pruebas cutáneas (r=0.65, p<0.001), TAB y liberación de histamina Ag-específica (r=0.75, p<0.001), producción Ag-específica de sulfidoleucotrienos CAST (Bulhmann , Suiza) (r=0.7, p<0.001) e IgE específica CAP (Pharmacia, Suecia)(r=0.67, p<0.001).
La sensibilidad de la técnica para alergenos inhalantes (Der p o Lolium perenne) fue del 0.93 y la especificidad del 0.82. Consideramos como positivos, los resultados del TAB para inhalantes a partir de un punto de corte del 10% de activación con respecto a la basal.
El diagnóstico in vitro de alergia a inhalantes no es difícil, y en este estudio demostramos la fiabilidad del test de activación de basófilos mediante citometría de flujo, utilizando dos alergenos bien caracterizados. Este estudio nos sirvió como punto de partida para estudiar otros alergenos no tan bien caracterizados como los alimentos y medicamentos, con los que deberemos analizar, de la misma manera, el comportamiento de esta técnica y establecer los puntos de corte para considerar la prueba como positiva.

2. Látex

Estudiamos 16 casos de pacientes alérgicos a látex, que presentaban manifestaciones cutáneas (urticaria y/o angioedema), respiratorias (rinitis, asma), conjuntivitis o anafilaxia, tras contacto con látex. En todos ellos, la prueba cutánea fue positiva (prick>3mm).
Realizamos TAB frente a extracto acuoso de látex (Bial Aristegui, Bilbao) a concentraciones crecientes 1/10, 1/40, 1/160 y observamos resultados positivos de TAB en 15 de los 16 casos estudiados.
En paralelo, se realizaron 10 controles y en todos ellos resultó negativo el TAB frente a látex a cualquiera de las concentraciones ensayadas.
Según estos resultados preliminares el TAB es una técnica útil en el diagnóstico de alergia a Látex. Conviene utilizar diluciones a partir de 1/10, para evitar resultados inespecíficos.
Para un punto de corte de positividad del 8%, la sensibilidad de la técnica fue del 0.87 y la especificidad de 1

Alergia a Betalactámicos

Seleccionamos una casuística de 41 pacientes alérgicos a betalactámicos (43+17 años) con reacciones clínicas de urticaria y/o angioedema y/o anafilaxia y/o shock, tras la administración de betalactámicos y/o test de provocación positivo. Como criterio de inclusión, la prueba cutánea frente a betalactámicos debía ser positiva.
Los controles estudiados fueron 16 sujetos sanos (37 + 15 años) y 16 atópicos (28 + 12 años).
En todos ellos se determinó la activación de basófilos in vitro tras estímulo frente a Penicilina, Ampicilina, Amoxicilina, PPL y MDM.
En cuanto a los resultados obtenidos, no observamos diferencias significativas entre activación basal y en respuesta al Ag en ambos grupos control.
En pacientes alérgicos a betalactámicos encontramos diferencias claramente significativas entre Tab basal (2.0+1.7%) y activación Ag-específica (7.2+10.7%) con respecto al control (p<0.001).
Encontramos una correlación positiva y significativa entre TAB y producción Ag-específica de sLT (CAST) (r=0.39, p<0.001) y entre ambas técnicas en respuesta a la Anti-IgE (r=0.4, p<0.001).
La sensibilidad de la técnica fue del 0.56 frente al 0.37 observada para la determinación de IgE específica mediante CAP. La especificidad fue del 0.95, igual que la IgE específica.
Establecimos los puntos de corte de positividad de la técnica en un índice de estimulación = Ag/basal >2 cuando la basal era igual o menor de 2%. Cuando la basal era inferior a 2%, el TAB frente a Ag fue positivo, cuando era mayor del 5%.
Consideramos que el test de activación de basófilos constituye una técnica fiable, no invasiva y segura en el diagnóstico de alergia a betalactámicos, pudiendo en un futuro ser el test de elección.

Alergia alimentaria

Estudiamos una serie de 70 pacientes con historia sugestiva de alergia alimentaria frente a diversos alimentos (huevo, leche, frutas, frutos secos, legumbres, etc.) con prueba cutánea positiva frente a dichos alergenos.
Los controles incluidos fueron 42 pacientes atópicos, sin sensibilización previa a alimentos y con prueba cutánea negativa.
31/52 pacientes con prueba cutánea positiva mostraron un TAB positivo frente a Ag. En el grupo con prueba cutánea negativa, 17/33 resultaron negativos. Estos resultados preliminares mostraron una sensibilidad del TAB para alimentos del 0.82 y una especificidad del 0.62

Conclusiones

Estos resultados preliminares nos permiten afirmar que el TAB demuestra tener una buena correlación con otras técnicas de diagnóstico in vitro, para diversos alergenos, siendo útil como complemento diagnostico para algunos alergenos y capaz de mejorar el rendimiento diagnóstico en algunas patologías alérgicas de difícil diagnóstico in vivo e in vitro, tales como la alergia frente a alimentos y algunos medicamentos (betalactámicos), donde esta técnica se revela, según nuestros resultados como un método no invasivo y fiable en el diagnóstico in vitro. Consideramos imprescindible establecer el punto de corte de positividad para cada tipo de alergeno, en este sentido tendrá especial interés (y en ello estamos trabajando actualmente ) estudiar el comportamiento de alergenos tales como alimentos y medicamentos.

Bibliografía

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3. Knol EF, Mul FP, Jansen H, Calafat J, Roos D. Monitoring himan basophil activation via CD63 monoclonal antibody 435. J Allergy Clin Immunol 1991;88:328-38
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