ALERGENOS DEL POLEN DE S. kali
Carnés Sánchez J, Fernández-Caldas E.
Departamento de
Investigación y Desarrollo. C.B.F. LETI, S.A. Tres Cantos, Madrid
INTRODUCCIÓN
El
nombre de Salsola procede del latín sallere
que significa salar en referencia a la alta tolerancia que tienen este tipo de
plantas para vivir en suelos salinos. Según diferentes autores, en el género
Salsola se incluyen entre 100 y 200 especies con una gran variabilidad de
hábitats y características propias[1].
S. kali es una planta anual que se
desarrolla durante el verano y parte del otoño. Morfológicamente son arbustos
de tamaño variable, esféricos y que tras florecer adquieren un tono marrón
grisáceo. A finales del verano, la planta se seca y el tallo se rompe a ras del
suelo, convirtiéndose en una planta rodadora que es empujada por el viento
dispersando entre 20.000 y 50.000 semillas en su recorrido. La polinización se
realiza entre los meses de Junio y Octubre, alcanzándose las mayores cotas
durante el mes de Agosto y Septiembre.
Es
prácticamente una planta cosmopolita que se extiende por la mayoría de las
regiones costeras de Europa y de los países del Mediterráneo y por ambas costas
de los EEUU. En España está ampliamente distribuida, sobre todo en la costa,
Aragón y regiones de precipitaciones no muy elevadas. En estas zonas el polen
puede representar hasta un 5% del total[2]
de pólenes del área.
El
primer caso de sensibilización por polen de Salsola fue descrito en 1933 por
Lamson et al.[3]. En 1978
Powell et al. [4]
describieron en los Estados Unidos dos casos por dermatitis de contacto después
de la manipulación de Salsola. Shafiee[5]
describió 9 pacientes con hipersensibilidad a polen de Salsola en Irán,
demostrando niveles elevados de IgE específica. En España y en los países
Mediterráneos es responsable de un elevado número de sensibilizaciones[6],[7].
En 1998 se hicieron públicos una serie de estudios sobre las prevalencias de
sensibilización en diferentes regiones de España, y en donde los pacientes
sensibilizados a Salsola kali
representaban un alto porcentaje. Los máximos niveles se encontraban en la
provincia de Toledo con hasta un 68% de sensibilizaciones, seguido de Ciudad
Real y Zaragoza, con un 51 y 35% respectivamente[8].
El
objetivo del presente trabajo fue preparar un extracto de polen de S. kali y realizar una caracterización
del mismo. A continuación la proteína mayoritaria fue seleccionada, purificada,
caracterizada tanto antigénica como alergénicamente, in vitro e in vivo,
secuenciada y estudiada su homología con otras proteínas del banco de datos.
Para
fabricar el extracto se utilizó polen de
S. kali (Biopol Laboratory Inc., Washington, USA) con una riqueza superior
al 95%. Cincuenta gramos de polen fueron diluidos en PBS 0.01 M (pH 7.4) en una
proporción 1:10 y extraídos durante 4 horas a 4ēC. Transcurrido el tiempo, el
extracto fue centrifugado a 10,000 r.p.m. durante 30 minutos, y el sobrenadante
recogido. El precipitado fue resuspendido nuevamente en PBS 0.01 M (pH 7.4) en
una proporción 1:10 peso/volumen y extraído durante 16 horas. Transcurrido el
tiempo fue centrifugado a 10,000 r.p.m y el sobrenadante recogido y mezclado
con el de la primera extracción. El extracto fue filtrado, dializado, congelado
y liofilizado. El contenido proteico fue medido por Lowry Biuret (Sigma Diagnostics. St Louis. USA).
El perfil antigénico del extracto fue analizado mediante SDS-PAGE
e IEF.
Para el SDS se utilizaron geles con una composición de 2.67%C y
15%T de acrilamida/bisacrilamida[10].
Cincuenta microgramos de proteína fueron cargados en el gel en condiciones
reductoras. Después de la electroforesis, el gel fue teñido con azul de
Coomassie y el perfil estudiado mediante Scanner Sharp JX-330.
El
isoelectroenfoque se realizó en geles con un gradiente de pH entre 3 y 10. Las
muestras fueron aplicadas directamente sobre el gel y corridas según
condiciones eléctricas específicas. A continuación fueron teñidos con Azul de Coomassie.
Las muestras separadas por electroforesis fueron
electrotransferidas a una membrana de P-Immobilon (Millipore. Bedford. USA). La
membrana fue secada a temperatura ambiente durante 4 horas e incubada toda la
noche con el pool de sueros. La unión específica antígeno-anticuerpo fue
detectada mediante anticuerpo monoclonal IgE marcado previamente con
peroxidasa.
Una
proteína de aproximadamente 43 kDa fue seleccionada para su purificación y
caracterización. El extracto nativo se purificó mediante cromatografía de
filtración en gel utilizando un equipo de FPLC. Como matriz se utilizó Sephadex
G-75 y la muestra fue eluída con PBS 0.01 M. Al final se obtuvo un cromatograma
donde las fracciones proteicas se juntaron y los pigmentos fueron desechados.
Ambas muestra fueron analizadas con respecto al extracto nativo mediante ELISA
inhibición para determinar su actividad biológica.
Para el
siguiente paso de purificación se utilizó un sistema de electroforesis continua
(491 Prep Cell. BioRad. USA)[11].
Un total de 5 mg de la fracción proteica obtenida previamente se diluyó en
tampón SDS y en condiciones no reductoras. Las fracciones que contenían la
proteína purificada fueron mezcladas y dializadas por membranas de 10 kDa
frente a agua bidestilada. A continuación la proteína fue filtrada, congelada y
liofilizada. El SDS de la muestra se eliminó mediante el kit de Pierce
(Rockford. Illinois, USA).
Cada
muestra de suero fue diluida 1:2 en PBS 0.01M e incubado durante 2 horas en las
placas. Después de lavar, las placas se incubaron nuevamente con anti IgE
humana marcada con peroxidasa. Además de las muestras de 66 pacientes se
pusieron 3 muestras que se utilizaron como controles negativos. Los resultados
de los sueros fueron considerados positivos cuando se obtuvo una Densidad
óptica superior a 4 veces la media de los 3 controles.
La
muestra fue primeramente enfocada mediante IEF utilizando como material
instrumental el IPGphor (Amersham Pharmacia Biotech, Uppsala, Sweden) en un
gradiente lineal de pH 3-10. Después de ser enfocadas, las tiras se
resuspendieron en buffer de SDS durante 30 minutos y se separaron atendiendo
al tamaño molecular. Transcurrido el
tiempo los geles fueron teñidos con plata y escaneados.
El
extracto una vez separado en ambas dimensiones fue electrotransferido a una
membrana de celulosa. La membrana se bloqueó durante 2 horas en leche desnatada
y a continuación se incubó con un pool de sueros. Posteriormente y después de
lavar se incubó con anti IgE humana marcada con peroxidasa.
Puesto
que el extremo amino terminal de la proteína se encontraba bloqueado, la
proteína fue fragmentada con tripsina obteniéndose 4 péptidos internos[12].
Estos fueron secuenciados mediante
espectrometría de MALDI-TOF según el procedimiento de Konecny et al.[13].
El análisis se llevó a cabo con un aparato Kompact
Probe (Kratos-Shimazdu, Manchester, UK).
Se
realizó ELISA inhibición del extracto completo y de la proteína para valorar su
actividad biológica in vivo. Para
ello se tapizó una placa (Immulon IV. Dynex Technologies. Chantilly. USA) con extracto
completo. Con cada muestra se realizaron varias diluciones a fin de obtener una
recta. Las muestras fueron incubadas con suero durante 2 horas y a continuación
depositadas en la placa previamente tapizada con el extracto nativo e incubadas
toda la noche.
Después de lavar la placa se incubó con anti IgE humana marcada con peroxidasa durante 2 horas y transcurrido el tiempo la muestra fue desarrollada. La actividad alergénica de ambas muestras fue evaluada calculando el 50% de inhibición, usando como control un pool de sueros no inhibido previamente.
Prueba
cutánea
Veinte pacientes con prick positivo a Salsola fueron testados frente a la proteína purificada (0.5 mg/ml) mediante prueba cutanea y frente a los pigmentos del extracto nativo (5 mg/ml). Además 10 individuos fueron utilizados como control negativo.
RESULTADOS
El
contenido proteico del extracto completo fue de 815,0 mg de proteína por mg de
liofilizado. Tanto la fracción proteica como la de pigmentos, obtenidas después
de la filtración en gel, fueron analizadas por ELISA inhibición, obteniéndose
unos valores de 50% de inhibición de 0.074 mg para el extracto nativo,
0.076 mg para la fracción
del perfil proteico y de 1507.63 mg para la fracción
de pigmentos. El análisis mediante SDS-PAGE de ambas fracciones dio como
resultado una banda limpia en el caso de la fracción de pigmentos. La fracción
proteica se purificó aislándose una proteína de 43 kDa.
El estudio del perfil antigénico, atendiendo al punto isoeléctrico de las proteínas, demostró que en el extracto aparecían bandas con un rango desde 3.5 a 9, predominando las proteínas de carácter ácido.
El perfil antigénico en función del tamaño molecular mostró bandas proteicas con pesos moleculares entre 7 y 98 kDa.
El análisis del extracto mediante gel bidimensional confirmó estos resultados mostrando que para proteínas de igual peso molecular aparecían varias isoformas.
El
estudio de la proteína purificada mediante SDS-PAGE y gel bidimensional
demostró que aparecía una única banda aislada de alrededor de 43 kDa y con 6
isoformas diferentes cuyo punto isoeléctrico oscila entre 5.5 y 7.
Un total
de 39 pacientes (59.1%) presentaron IgE específica frente a extracto completo,
siguiendo el criterio previamente expuesto de tomar como positivos aquellos
sujetos con valores de OD superiores a 4 veces el control negativo. Del total
de pacientes con IgE positiva a S. kali,
26 de ellos presentaron IgE específica frente a la proteína purificada, lo que
representa el 66% de los pacientes con IgE específica a S. kali.
Caracterización alergénica
El
perfil alergénico mostró que en el extracto completo existen varias bandas de
entre 36 y 90 kDa (36, 43, 57, 69, 81 kDa), con capacidad de reconocimiento de
IgE. Una única banda fue reconocida en el caso de la proteína purificada.
El
inmunoblot en gel bidimensional de la proteína purificada mostró que al menos
existen 6 isoformas de peso molecular aproximado de 43 kDa que presentan capacidad
de unión de IgE.
Para
determinar la actividad biológica del extracto completo y de la proteína
purificada se realizó ELISA inhibición utilizando el pool de sueros de los
pacientes. En ambos casos se calculó el 50% de inhibición. Las curvas obtenidas
mostraron un coeficiente de regresión superior a 0.95 y ambas cumplieron el
test de paralelismo. Un total de 1.12 mg de proteína fueron
necesarios para alcanzar el 50% de inhibición en el extracto completo, mientras
que 2.08 mg de proteína fueron
necesarias en el caso de Sal k 1.
Los 20
pacientes positivos testados presentaron prueba cutánea positiva a la proteína
purificada y al extracto completo mientras que ninguno de ellos reconoció el
prick fabricado a partir de los pigmentos desechados. La media geométrica de las pápulas fue de 44.9 mm2
(7-127) para el extracto nativo y de 70.9 mm2 (17-195) para la
fracción purificada. El coeficiente de correlación obtenido entre ambos pricks
fue de 0.73. Ninguno de los controles negativos utilizados dio pápula frente a
ninguno de los 3 pricks.
Después de la digestión con tripsina, se obtuvieron 4 péptidos internos que fueron secuenciados mediante espectrometría de masas MALDI-TOF. No se encontraron homologías con otras proteínas.
La
proteína ha sido dada de alta en el Swiss Prot data bank con el número P83181 (http.//us.expasy.org/cgi-bin/niceprot.pl?p83181)
y nombrada como Sal k 1 en el banco de datos de alergenos (www.allergen.org).
CONCLUSIONES
Los
extractos de S. kali presentan una
gran cantidad de bandas proteícas, de las cuales, la más predominante es una
banda de 43 kDa. Esta banda representa entorno al 25% del contenido proteíco
(medido por densitometría) y ha sido descrita y nombrada como un alergeno mayor
del polen de S. kali. Sal k 1
presenta 6 isoformas con puntos isoelectricos comprendidos entre 5.5 y 7.
Presenta una alta tasa de reconocimiento in
vitro (66%) en pacientes sensibilizados a S. kali y una tasa de reconocimiento del 100% in vivo. Es un alergeno con gran importancia alergénica, confirmado
por los resultados de inhibición de ELISA. Se han secuenciado 4 péptidos
internos denominados IP1, IP2, IP3 e IP4 y hasta el momento no se ha encontrado
homología con otras proteínas descritas.
El presente trabajo
ha sido desarrollado en su mayoría en el Departamento de I+D de los
Laboratorios C.B.F. LETI S.A. por los doctores Fernández-Caldas E y Carnés
Sánchez J y con la colaboración de los doctores Alonso C y Marina C del Centro
de Biología Molecular Severo Ochoa, CSIC-Universidad Autónoma de Madrid, de los
doctores Lahoz C , Civantos E, del Pozo V, Cárdaba B, Vivanco F, Mas S y Durán
C del Dpto. de Inmunología de la Fundación Jiménez Díaz de Madrid y de los
doctores Colás C y Lezaun A del Servicio de Alergia del Hospital Clínico "Lozano
Blesa" de Zaragoza y gracias a la colaboración del personal del mismo,
Venturini M, Monzón S,
Lara S, Reichelt C, Domínguez MA, Fraj J, Duce F, Abadía C, Sobrino L, Bretos
A, Roche V, Saldaña J.
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