CARACTERIZACIÓN Y ESTANDARIZACIÓN DE UN EXTRACTO NATURAL DE LÁTEX
Dr. Víctor ALVÁ
Departamento Médico STALLERGENES DHS ESPAÑA, Barcelona
El látex es un producto natural secretado por las células laticíferas del árbol del caucho, Hevea brasiliensis, perteneciente a la familia de las Euforbiáceas. H. brasiliensis se cultiva en distintos países tropicales (Malasia es uno de los principales exportadores) para la producción de caucho natural. El látex se obtiene por sangrado del árbol, se recoge en recipientes, se añade amoníaco u otros productos para evitar su coagulación espontánea y, tras distintos procesos de manufacturación (entre ellos la concentración y la vulcanización) se produce la materia prima para la fabricación de artículos de goma (producto final del látex).
El látex natural tiene una composición compleja. Básicamente está constituido por agua y polímeros de cis-1-4-polisopropeno (goma natural), además de pequeñas cantidades de glúcidos, lípidos, proteínas y moléculas inorgánicas. El contenido de proteínas en el látex es bajo (entre el 1 y el 2%) pero su diversidad es alta, habiéndose descrito hasta 240 polipéptidos distintos, de un peso molecular de entre 2 y 100 kDa y puntos isoleléctricos en la zona de 4 a 6,5 (1, 2, 3). Se ha demostrado que alrededor del 25% de estos polipéptidos fijan la IgE de sueros de pacientes alérgicos al látex (3). Actualmente se han descrito 12 alergenos del látex (Hev b 1-12) (lista de alergenos de la IUIS, 5 febrero 2002) e identificado otras proteínas que pueden estar implicadas en la alergia al látex. Entre éstas últimas, cabe señalar las quitinasas, posiblemente las responsables de la reactividad cruzada del látex con frutas y hortalizas (síndrome látex-frutas) (4).
Tanto el látex natural (amoniacal o no) como el producto final (p.e., guantes de látex) pueden contener una cantidad similar de alergenos, pero no está claro si la cantidad y las propiedades alergénicas de las proteínas naturales del látex se mantienen al añadirse amoníaco y durante la manufacturación (5, 6). El amoníaco reduce de forma incontrolada el pH de la solución e hidroliza las proteínas, como parece indicar el menor peso molecular de los péptidos encontrados en el látex amoniacal. También el almacenamiento y los distintos procesos industriales de manufacturación contribuirían a alterar la estructura y composición de los péptidos naturales del látex. Todo ello conduce a considerar el látex natural como la materia prima idónea para la fabricación de extractos estandarizados destinados al diagnóstico y al tratamiento de la alergia al látex (7).
En los últimos veinte años la alergia al látex se ha revelado como un auténtico problema en las personas expuestas a su contacto, principalmente personal sanitario, trabajadores de la industria del caucho y pacientes multioperados (en particular, aquellos presentando espina bífida). Su prevalencia en la población general es de alrededor del 1 %, pero en las poblaciones de riesgo la incidencia puede alcanzar hasta el 65%, variando estas estimaciones según el colectivo estudiado, el sexo, el país y el método empleado para el diagnóstico (8, 9). Las manifestaciones clínicas de la alergia al látex es múltiple, observándose dermatitis de contacto, urticaria, eccema, conjuntivitis, rinitis, asma y anafilaxia. El grado de exposición y la atopia parecen ser determinantes para el desarrollo de la alergia (8, 10, 11). Es por este motivo que resulta imprescindible disponer de métodos fiables de diagnóstico que confirmen la historia clínica del paciente y permitan adoptar medidas de prevención oportunas. Las pruebas cutáneas, en particular el prick test, muestran una mayor especificidad y sensibilidad que ciertos métodos in vitro (p.e., niveles de IgE específica en suero) (12, 13). Ha sido habitual el empleo de prick test confeccionados con extractos artesanales a partir del latex natural o de guantes. Sin embargo, su reproducibilidad y seguridad son bajas, habiéndose observado reacciones adversas (incluso anafilaxia) con este tipo de extractos (14, 15). Actualmente se dispone en Europa de distintos extractos comerciales pero tan sólo uno de ellos está estandarizado. A continuación se describen los principales procesos de caracterización y estandarización biológica de un extracto de látex natural no amoniacal realizado en 1994(16) y comercializado desde 1995. En 1999 se ha renovado el extracto de referencia interno del laboratorio con la misma materia prima y siguiendo el mismo método.
El látex natural se obtuvo por sangrado de 15 árboles de Hevea brasiliensis del clon RRIM 600 en el Rubber Research Institute of Malaysia, en Kuala Lumpur (Malasia). El látex se recogió en recipientes de teflón y se congeló inmediatamente a -70º C. Se transportó congelado en hielo seco en un plazo máximo de tres días hasta los laboratorios de STALLERGENES en Antony (Francia) y se conservó a -20º C. Se descongeló a +4º C ambiente, se separó por presión el coágulo del líquido circundante y se ultracentrifugó en frío durante tres horas. El supernadante, denominado materia prima del látex, se filtró a través de membranas de 0,45 mm, se separaron alícuotas y se congeló y almacenó a -20º C.
El extracto de referencia interno (IHRS: in house reference standard) se obtuvo diluyendo la materia prima del látex en una solución de manitol al 2% en agua destilada. Se filtró a través de membranas de 0,22 mm y se liofilizó. El IHRS se comparó con el extracto de látex FDA-E8 de la Food and Drug Administration (FDA, Estados Unidos).
Se escogieron sueros de referencia de cinco pacientes presentando anticuerpos IgE en immunoblotting a los principales alergenos. Cuatro pacientes eran adultos y uno un niño presentando espina bífida. Estos pacientes presentaban uno o más de los siguientes síntomas clínicos: urticaria, edema facial, rinitis o asma.
Los pacientes incluidos en la estandarización biológica se dividieron en dos grupos. El grupo control lo constituyeron 66 sujetos asintomáticos al látex, con prick test con extracto de guante negativo; el 40% presentaban prick test positivo a otros alergenos distintos del látex. El segundo grupo lo formaron 46 pacientes alérgicos al látex, 4 hombres y 42 mujeres, de entre 26 y 67 años. Todos ellos eran personal sanitario con síntomas de urticaria de contacto, edema facial, eccema, conjuntivitis, rinitis o asma. El prick test fue positivo en todos ellos y 41 pacientes (89%) presentaron valores de RAST (CAP System, Pharmacia, Uppsala, Suecia) superiores a 0,4 kU/l.
Caracterización in
vitro de las proteínas y alergenos del extracto
El contenido proteico total se determinó mediante el método de Bradford (Bio-Rad Protein Assay Kit, Richmond, EE.UU) con seroalbúmina bovina como referencia. La materia prima de látex contenía 7,5 mg/ml de proteínas. La concentración en el IHRS fue de 219 mg/ml y en el extracto final estandarizado a 100 IR (ver más adelante el método de estandarización biológica) de 22 mg/ml. Las proteínas totales en el extracto de la FDA fue de 1.200 mg/ml.
La actividad alergénica total mediante RAST inhibición del extracto FDA-E8 fue 55 veces superior a la del extracto a 100 IR. A igual concentración de proteínas (219 mg/ml), la actividad de los alergenos al látex de ambos extractos fue similar.
La caracterización de las proteínas mediante electroforesis SDS-PAGE puso en evidencia un patrón con numerosas bandas proteicas (entre 20 y 30) (Fig. 1). Los perfiles de las bandas fueron muy similares en los extractos de materia prima, IHRS y FDA-E8, así como en un cuarto extracto de látex natural empleado en el National Public Health Institute de Helsinki (Finlandia). Después de efectuar un immunoblotting con los sueros de referencia, se detectaron más de 10 alergenos fijadores de IgE incluyendo proteínas de unos 14, 20, 27, 30 y 45 kDa, correspondientes a los principales alergenos descritos en la literatura (Fig 1).
Mediante isoelectroenfoque (IEF) se pusieron en evidencia unas 40 bandas comprendidas entre los puntos isoeléctricos (pI) 4 y 6 (Fig 2). Tras immnuoblotting, se detectaron dos bandas fijadoras de IgE en los pI de 7,3 y 9,4. Los perfiles de los distintos extractos empleados fueron prácticamente idénticos.
En electroforesis
bidimensional, el extracto IHRS mostró 22 arcos de precipitación mediante
immunoelectroforesis cruzada (CIE) y cuatro en radioimmunoelectroforesis
cruzada (CRIE) (Fig. 3).
Estandarización biológica del extracto
La reactividad del extracto de látex se determinó mediante la técnica de prick test. Se asigna arbitrariamente un índice de reactividad (IR) de 100 IR/ml a aquella concentración del extracto que, mediante el empleo de la lanceta StallerpointÒ, provoca una pápula de un diámetro medio de 7 mm (media geométrica). Para ello se prepararon tres diluciones del extracto IHRS a 1:20, 1:200 y 1: 2000 en p/v. A cada paciente incluido en la estandarización se le practicaron dos controles positivos (fosfato de codeína 9%), dos controles negativos (solución glicerosalina) y cuatro pricks para cada una de las tres diluciones del extracto (en total, doce pricks con látex). Transcurridos 20 minutos, se transfirieron los contornos de las pápulas a la hoja de registro empleando una cinta adhesiva, se midieron los diámetros de las pápulas y se calculó sus medias geométricas.
Con los datos obtenidos se obtuvo la recta de regresión:
log (diámetro pápula) = 1,24 + 0,177 log (concentración) (r = 0,97)
permitiendo definir la concentración de 100 IR/ml a la dilución 1:172 correspondiendo a una pápula de diámetro medio de 7 mm.
Cuarenta y tres pacientes de 46 dieron una respuesta positiva en prick test, atribuyendo al extracto una sensibilidad del 93%. Todos los pacientes del grupo control (77) dieron negativo en la pruebas, siendo la especificidad del 100%. El valor predictivo negativo fue del 100% y el valor predictivo positivo del 96%.
No se observó ninguna reacción adversa severa y sólo dos pacientes presentaron síntomas de rinitis leve. Teniendo en cuenta que se efectuaron simultáneamente 12 prick test (cuatro de ellos con una concentración elevada, equivalente a 220 mg/ml), el extracto estandarizado de látex presenta un alto perfil de seguridad.
No se observó ninguna degradación en tres lotes almacenados durante un año a 4º C, 24º C y 37º C, demostrando la estabilidad del extracto. Igualmente, la estabilidad del prick test se mantiene durante 3 años a +4º C. Transcurridos cinco años, se repitieron las electroforesis de SDS-PAGE, IEF (ambas seguidas de immunoblotting), CIE y CRIE y se compararon con un nuevo extracto estandarizado. No se observó ninguna diferencia significativa entre ambos extractos, demostrando igualmente la estabilidad del extracto de latex (Figs 1 y 2).
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Figura 1. SDS-PAGE e immunoblotting: Extracto estandarizado en 1995 (LA); Extracto estandarizado en 1999 (LN).
Figura 2. IEF: Extracto estandarizado en 1995 (LA); Extracto estandarizado en 1999 (LN).
Figura 3. CIE y CRIE del extracto IHRS estandarizado
en 1995.