INMUNOTERAPIA ESPECIFICA CON ALERGENOS DE LATEX (2ª PARTE)

SELECCION DE ALERGENOS

 

Domingo Barber, Manuel Lombardero, Santiago Martín, Pilar Rico

ALK-ABELLO S.A.

Madrid

 

INTRODUCCIÓN

 

Aproximadamente entre el 2 y 3% del látex natural son proteínas. Si consideramos el porcentaje sobre peso seco, este tanto por ciento se duplica.    Los productos procesados de látex, como los guantes, pueden contener aún hasta un 3% de proteína.

            La mayor parte de los trabajos científicos publicados sobre la caracterización de alergenos de látex se han realizado sobre látex natural. Este hecho es relevante porque, dado que la utilización  industrial del látex implica siempre una estabilización previa, fundamentalmente por adición de amoniaco, y la centrifugación y concentración de las partículas de caucho natural, las composiciones proteica y alergénica del producto final sufren cambios significativos respecto al látex natural.

La adición de amoniaco desnaturaliza y precipita varios componentes proteicos. La centrifugación supone la eliminación de los lutoides (en el llamado suero B) y la disminución de los componentes no asociados a las partículas de caucho.

Figura 1: SDS-PAGE de extractos de látex. 1 y 2: extracto amoniacal. 3.- látex natural. 4.- Marcadores de peso molecular (se indica a la derecha en kDa)

 

Tal como se muestra en la figura 1, cuando comparamos los perfiles de proteínas de extracto amoniacal y de látex natural, mediante electroforesis en geles de acrilamida en presencia de SDS, se observan diferencias muy significativas. Mientras el extracto de látex natural presenta gran cantidad de bandas en un rango de pesos moleculares de 5 a  >100 kDa de similar intensidad, en el extracto amoniacal no se detectan prácticamente bandas de alto peso molecular (> 60 kDa) y aparece una redistribución de bandas de bajo peso molecular con desapariciones de bandas de 20 kDa y aparición de nuevas proteínas de bajo peso molecular (alrededor de 6kDa).

 

Figura 2: IgE-Inmunodetección de extractos de látex. 1.- Látex natural. 2.- Control negativo. 3.- Extracto de guante de látex. 4.- Extracto amoniacal.

 

Si se realiza una inmunodetección de IgE con un pool de sueros de pacientes alérgicos a látex en los mismos extractos  y en un extracto de guante (figura 2), observamos también diferencias significativas. Los perfiles alergénicos del extracto amoniacal y del guante son bastante coincidentes. De nuevo la banda de bajo peso molecular (6 kDa) parece ser la más relevante en el extracto amoniacal. Además observamos dos bandas significativas aproximadamente a 14 y 40 kDa respectivamente. En el caso del látex natural, el alergeno de 6 kDa se detecta débilmente, y aparece una banda de »20 kDa, que no aparece en el extracto amoniacal y guante, y una serie continua de bandas de mayor peso molecular. La proteína de 20kDa se ha identificado como proheveína. Esta proteína se procesa durante el tratamiento amoniacal liberando un péptido de 6kDa, denominado dominio heveína, correspondiente a la región N-terminal de la proheveína.

            El estudio de los alergenos del látex se complica aún más por la existencia de panalergenos. Estas moléculas pueden actuar como sensibilizantes primarios en el látex, pero también pueden inducir IgE a través de otras fuentes alergénicas (por ej.: frutas y pólenes). Estos panalergenos comunes al látex y a otras fuentes pueden explicar casos de reactividad cruzada como por ej.: el conocido síndrome látex-frutas.

 

En los últimos años, la utilización de técnicas de biología molecular ha permitido la identificación y caracterización de más de 11 proteínas con actividad alergénica en el látex natural. La prevalencia a nivel de IgE varía ampliamente y lo que es más importante, varía también dependiendo del tipo de paciente: Profesionalmente expuesto y multioperado. No está claro si estas diferencias se deben al modo de presentación del alergeno, a una propiedad intrínseca de este o a una combinación de ambos. Quizás simplificando el panorama en exceso, el factor de elongación y su homólogo (Hev b 1/Hev b 3) se asocia principalmente con pacientes con espina bífida mientras que la proheveína/heveína (Hev b 6) es más relevante en pacientes profesionalmente expuestos. No obstante, existen alergenos como el Hev b 2 (b-1,3 glucanasa) y Hev b 5 (proteína ácida) que parecen ser relevantes en ambos grupos.

            La existencia de panalergenos con secuencia conservada (principalmente quitinasas clase I y profilinas) en el látex natural y otras fuentes alergénicas de origen vegetal (pólenes y alimentos vegetales) ha permitido explicar la existencia de reactividad cruzada a nivel clínico en ciertos grupos de pacientes. Existe otro grupo de panalergenos, (b-1,3 glucanasas, enolasa, …) cuya importancia a nivel de reactividad cruzada no está todavía establecida.

 

Tabla I.- Alergenos del látex

 

Alergeno	NOMBRE	MW	AA	Función	Localización  Subcelular	Clasificación1 clínica
Hev b 1	Factor de elongación	14,6	137	Biosíntesis de la molécula de polisiopreno	Partículas de caucho	Mayoritario multioperados Relevante en trabajadores Hospital
Hev b 2	b-1,3 glucanasa	35,1	374	Proteína de defensa b-1,3 glucanasa	Lutoides	Relevante
Hev b 3	Homólogo  factor  elongación	23-27	-	Homólogo a Hev b 1 Síntesis del polímero	Partículas de caucho de pequeño tamaño	Mayoritario multioperados Relevante en trabajadores Hospital
Hev b 4	Componente de Microhélice	50-57	-	Proteína estructural	Lutoides	Minoritario
Hev b 5	Proteína ácida	16	151	?	Citoplasma	Mayoritario
Hev b 6	Preheveina Heveína	20 4,7	187 43	Proteína de defensa Coagulación	Lutoides	Mayoritario
Hev b 7	Patatina	42,9	389	Proteína de defensa Esterasa	Citoplasma	Relevante
Hev b 8	Profilina	10,2-15,7	-	Proteína del citoesqueleto Liga actina	Citoplasma	Minoritario
Hev b 9	Enolasa	51		Enolasa	Citoplasma	Minoritario
Hev b 10	Superóxido dismutasa	25,8	233	Superóxido dismutasa	Mitocondria	Minoritario
Hev b 11	Quitinasa clase I			Quitinasa		Minoritario
1Mayoritario > 60% pacientes sensibilizados   Intermedio    > 20% pacientes sensibilizados   Minoritario <  20% pacientes sensibilizados

 

CRITERIOS DE SELECCIÓN DEL EXTRACTO:

 

A la hora de seleccionar un extracto de látex hay que valorar primero las opciones existentes y analizar las ventajas e inconvenientes de cada una de ellas. Como veremos no existe una alternativa obvia.

 

Hemos señalado anteriormente que las dos alternativas existentes son utilizar bien un extracto natural de látex o un extracto estabilizado con amoniaco.

 

EXTRACTO NATURAL

 

Para preparar un extracto natural de látex hay que recoger éste directamente del árbol sobre un tampón adecuado y procesarlo rápidamente. Mediante centrifugación y lavado de las distintas fracciones se obtienen los componentes asociados a lutoides, partículas de caucho y suero.

 

El extracto así preparado contiene todos los componentes proteicos del látex en proporciones comparables según se observa en los patrones electroforéticos del mismo.

 

El extracto natural  no se utiliza nunca en la preparación de productos derivados de látex. Dada su extrema inestabilidad previamente a su utilización industrial el látex se estabiliza fundamentalmente por adición de diversas concentraciones de amoniaco. Dada la presencia de moléculas que actúan como panalergenos en un extracto natural, que pueden ser total o parcialmente eliminadas durante el tratamiento con amoniaco, se pueden obtener resultados inespecíficos o no relevantes clínicamente cuando utilizamos látex natural. Por otra parte el tratamiento con amoniaco supone la acumulación de diversos componentes proteicos que constituyen los componentes alergénicos más relevantes. Esto es especialmente obvio en el caso de la proheveína y la heveína. Ambas moléculas forman parte del alérgeno denominado Hev b 6. La heveína es de hecho la región N-terminal de la proheveína y se forma y concentra durante el procesamiento amoniacal. Las diferentes características físicas de estas dos moléculas podrían implicar diferentes perfiles farmacológicos (absorción, metabolismo....).

 

EXTRACTO AMONIACAL

 

El proceso de preparación del látex para su uso industrial se inicia recogiendo el látex  del árbol sobre recipientes que contienen amoniaco a fin de evitar la polimerización y contaminación bacteriana. A continuación el producto se centrífuga para concentrar las partículas de caucho. Los lutoides, y las proteínas asociadas a ellos son eliminados, asimismo los componentes solubilizados  en el suero ven reducida su concentración. Por otro lado las proteínas asociadas a las partículas de caucho incrementan significativamente su proporción relativa, e incluso algunas como la heveína, prácticamente ausente en el látex de partida, se convierte en la molécula mayoritaria del extracto.

Cuando analizamos y comparamos los perfiles proteicos y alergénicos obtenidos de suspensión amoniacal y de guantes, éstos coinciden. Es decir, que este extracto es el responsable de la sensibilización primaria a látex.

Junto a la heveína, la proteína ácida (Hev b 5) y la beta glucanasa (Hev b 2), parecen ser los componentes relevantes tanto a nivel cuantitativo como en significación clínica en el extracto. Mención especial merece el factor de elongación (Hev b 1). Esta proteína es probablemente la más abundante en el látex y está íntimamente ligada a las partículas de caucho siendo esencial para la formación de polímero. No obstante, su baja solubilidad hace que su concentración tanto en  extractos naturales como amoniacales de látex sea baja y es posible que la eficacia diagnóstica para pacientes monosensibilizados a Hev b 1 sea baja por diagnóstico cutáneo. De nuevo, las propiedades físico-químicas del alergeno condicionan su perfil farmacológico, mientras la molécula no es la más relevante como alérgeno en pacientes sensibilizados por vía inhalatoria, consecuencia de su baja biodisponibilidad, es el alérgeno mayoritario para pacientes multioperados en los que la exposición al mismo se realiza a través de partículas de caucho o de almidón depositadas en la herida y que liberarán el alérgeno posteriormente.

 

El resto de los componentes alergénicos también están presentes en el extracto amoniacal si bien su proporción relativa es mas baja que en el extracto natural.

 

PERFIL CLINICO DE AMBOS EXTRACTOS

 

Con el fin de clarificar el comportamiento clínico de ambos extractos se procedió a realizar la comparación de los dos en prueba cutánea en un grupo de 38 pacientes alérgicos a látex. El objetivo era valorar la potencia relativa de ambos y los perfiles de sensibilidad y especificidad en la población estudiada.

 

La mayoría de los pacientes incluidos eran trabajadores sanitarios aunque también participaron trabajadores de la construcción y de la industria alimentaria y pacientes multioperados. A todos ellos y a un grupo control de 25 sujetos no atópicos se les realizó prick test, por duplicado, con cuatro diluciones 1/5 de un extracto de látex amoniacal y natural, previamente estandarizado habiéndose observado un contenido de 377 µg de proteina por 100 HEP.

 

La relación de la actividad biológica entre ambos extractos se determinó mediante ensayo de líneas paralelas. Ésta viene dada  por la distancia horizontal entre las rectas dosis-respuesta correspondientes. La actividad biológica del extracto de látex natural fué 7.3 veces mayor que la del extracto amoniacal (figura 3).

 

Figura 3. Comparación de la actividad biológica mediante PLA de un extracto de látex natural y un extracto de látex amoniacal.

 

La sensibilidad del extracto de látex natural fué del 100% a la dosis máxima estudiada de 100 HEP/ml, reduciéndose al 92.1, 86.8 y 73.7% a 20, 4 y 0.8 HEP/ml con una especificidad del 100% excepto para la dosis de 100 HEP/ml que fué del 92% (figura 4). Los valores de sensibilidad del extraco amoniacal reflejaron la diferencia de actividad biológica, siendo ligeramente inferiores (figura 5) con la misma especificidad.

Figura 4. Sensibilidad y especificidad de un extracto de látex natural.

 

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Figura 5. Sensibilidad y especificidad de un extracto de látex amoniacal

Podemos concluir de este estudio que la actividad específica del extracto de látex natural es 7 veces superior a la del extracto amoniacal aunque ambos posean unas prestaciones diagnósticas similares a las concentraciones de uso. La baja concentración de algunos alergenos en el extracto amoniacal puede ser responsable de la disminución más abrupta de sensibilidad a dosis bajas encontrada en este extracto en relación al natural.

 

 

DESCRIPCIÓN DEL EXTRACTO UTILIZADO

 

El Extracto utilizado en el presente estudio de inmunoterapia es un extracto depot, adsorbido a gel de hidróxido de aluminio, de látex natural estandarizado biológicamente en HEPs.

La equivalencia HEP a proteína es de 38 mg de proteína total para 10 HEPs.

La robustez del proceso de fabricación se comprobó fabricando cuatro lotes independientes, que se compararon, mediante SDS_PAGE, con la referencia  de látex de la FDA, tal como se muestra en la figura.

            En la tabla se muestra la actividad biológica, determinada mediante LIA de inhibición, de los mismos cuatro extractos fabricados, obteniendo un coeficiente de variación inferior al 8%

  

 

            La estabilidad del extracto intermedio se comprobó tanto in vitro como in vivo, re-estandarizando el extracto utilizado al cabo de cinco años. Se obtuvo un valor de 9,8HEPs para un valor teórico de 10HEPs.

 

BIBLIOGRAFÍA RELEVANTE

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