Reuniones Anuales : Ponencias de la edición de 2004 : Segunda ponencia : Implicaciones clínicas de la reactividad cruzada

SEGUNDA PONENCIA:
Implicaciones clínicas de la reactividad cruzada

MODERADOR:
Dr. Carlos Colás.
Hospital Clínico Universitario. Zaragoza.

PERFILES DE SENSIBILIZACIÓN A LTPs EN ALERGIA POR PÓLENES, ALIMENTOS Y ALERGIA OCUPACIONAL
Domingo Barber Hernández (Director de Investigación. ALK-Abelló, S.A.)
Francisco Javier García-Sellés (Servicio de Alergia. Residencia Sanitaria Virgen de la Arrixaca. Murcia)
Gabriel Salcedo Durán (Catedrático de Bioquímica y Biología Molecular. Departamento de Biotecnología E.T.S. Ingenieros Agrónomos).

RESUMEN:
En los últimos años una nueva familia de proteínas alergénicas ha emergido con fuerza. Dicha familia, denominada genéricamente "Proteínas de transferencia de lípidos o LTPs", incluye alergenos presentes en diversos tejidos vegetales, siendo los agentes etiológicos de numerosas enfermedades alérgicas tanto por vía inhalada (polinosis, asma ocupacional) como por vía oral (alergia alimentaria).
La gran diversidad estructural existente entre los miembros de esta familia hace difícil determinar los perfiles de sensibilización de los pacientes y poder predecir el riesgo o instaurar el tratamiento adecuado.
La elevada severidad clínica de los pacientes sensibles a LTPs hace más necesario aún si cabe el avanzar en el desarrollo de nuevas herramientas diagnósticas que permitan estudiar el estado y evolución del paciente alérgico a LTPs.
En los últimos años hemos realizado diversos estudios que revelan que el número de componentes de la familia LTPs reconocidos por un paciente alérgico puede ser un indicador de severidad clínica o riesgo relativo. Asimismo existe una diferenciación geográfica en los perfiles de sensibilización de los pacientes. Dada la existencia de distintos patrones polínicos se nos plantea la pregunta de si la sensibilización inhalante a LTPs es un factor de riesgo para desarrollar alergia alimentaria con un amplio espectro de sensibilización.
En la presente ponencia se exponen los resultados preliminares de este estudio que parecen confirmar la hipótesis anterior.

1. Características generales de las LTPs:
La familia de proteínas, denominada LTPs (Lipid Transfer Proteins) por su capacidad in vitro de unir lípidos y transferirlos entre distintos sistemas de membranas, se encuentra ampliamente distribuida en el reino vegetal^1,2. Las LTPs son polipéptidos básicos (pI ( 9), con 91-95 aminoácidos en su estructura primaria y un tamaño molecular aproximado de 9 kDa. La identidad de secuencia entre diferentes miembros de la familia varía entre un 30% y un 95%. Sin embargo, todas ellas poseen 8 residuos de cisteína conservados, que forman 4 puentes disulfuro, responsables en gran medida del plegamiento compacto de estas moléculas1. Además, otros residuos altamente conservados se localizan alrededor de las posiciones 43-47 (T/S-X-X-D-R/K) y 81-85 (P-Y-X-I-S)³.
Su estructura tridimensional responde al tipo todo-a, con un dominio compacto formado por 4 hélices (separadas por giros cortos, y una cola C-terminal no estructurada³ (Fig. 1). Una larga cavidad interna a lo largo del eje mayor de la proteína constituye un potencial sitio de unión para ligandos hidrofóbicos (por ejemplo, colas hidrofóbicas de ácidos grasos). Otros alergenos vegetales, como los inhibidores de (-amilasa/tripsina de cereales y algunas proteínas 2S, presentan estructuras tridimensionales del tipo de las LTPs.

En la mayoría de las especies estudiadas, se han detectado diferentes isoformas (variantes genéticas) de LTPs, codificadas por una familia multigénica (hasta 15 genes en el sistema modelo vegetal de A. thaliana)^1,4,5. Muchas de estas isoformas tienen patrones específicos de expresión espacial y temporal, pero, en general, se localizan en las partes aéreas de la planta (hojas, semillas, flores, frutos), con niveles de expresión bajos o nulos en raíces^1,
4. Se acumulan preferentemente en la epidermis de distintos órganos^1,
6, lo que explica, en el caso de frutos como melocotón, el mayor potencial alergénico de la piel respecto a la pulpa⁷.
La función inicialmente propuesta para estas proteínas -transferencia intracelular de lípidos entre membranas de orgánulos- es incompatible con su localización extracelular^1,6. La evidencia experimental acumulada en los últimos años sugiere un posible papel de las LTPs en procesos de desarrollo, y en la adaptación de las plantas a situaciones de estrés (frío, salinidad). Como función más específica, se ha postulado su participación (transportando precursores) en la biosíntesis de cutina y otros polímeros lipofílicos extracelulares^1,3. Sin embargo, y siendo compatible con algunas de estas posibles funciones, la evidencia más sólida apunta a una implicación de las LTPs en los mecanismos de defensa de plantas frente a patógenos⁶. La identificación reciente en células de tabaco de receptores de LTPs relacionados con estos mecanismos de defensa⁸, y su participación como molécula señal en procesos de resistencia sistémica en Arabidopsis⁹, representan una evidencia adicional a favor de su papel como proteínas de defensa.

2. Estabilidad de las LTPs:
La resistencia a la hidrólisis por enzimas del tracto digestivo, particularmente pepsina gástrica, ha sido citada como una característica de los verdaderos alergenos alimentarios. Esta estabilidad estructural permitiría al alergeno contactar con el sistema inmune asociado al epitelio gastrointestinal en una conformación inmunogénica y alergénica, y provocar tanto sensibilización como síntomas sistémicos¹⁰. Por otro lado, la resistencia térmica del alergeno (en casos unida a la proteolítica) conlleva su presencia en forma activa en alimentos y bebidas procesados. Las LTPs poseen las dos características mencionadas anteriormente.
La resistencia a jugo gástrico simulado (pepsina a pH ácido)^11-13 y a proteasas acídicas de origen fúngico¹⁴ ha sido comprobada en LTPs alergénicas de melocotón (Pru p 3), cebada y zanahoria. En el caso de Pru p 3, su digestión por pepsina sólo se produce a un nivel apreciable después de 2 horas de incubación, y aún después de 24 horas un 40% del alergeno no ha sido procesado¹³. Además, las LTPs son proteínas altamente estables en tratamientos térmicos, con temperaturas de desnaturalización superiores a 100ºC^{12, 14}.
Su gran estabilidad explica que las LTPs hayan sido identificadas como alergenos relevantes en cerveza^{15, 16} y vino^{17, 18}. En cerveza, la LTP 1 de cebada sobrevive a los tratamientos térmicos y a la acción de proteasas presentes en la malta y en las levaduras, siendo una de las dos proteínas mayoritarias del producto comercializado^{12, 15}. Estas características también determinan que Pru p 3 se haya detectado en niveles clínicamente significativos en productos derivados de melocotón (jugos, mermeladas, yogures)^{13, 14}, y que la LTP de maíz (Zea m 14) provoque síntomas tras la ingestión de polenta o palomitas¹⁹.

3. LTPs alergénicas:
En los años ochenta y principios de los noventa, principalmente bajo el impulso de grupos de investigación norte y centroeuropeos, se describe a nivel molecular la asociación clínica existente entre sensibilización a polen de Fagales y sintomatología alérgica oral a Rosáceas^{20, 21}. La caracterización del alergeno de manzana Mal d 1 con elevada homología y reactividad cruzada con Bet v 1, alergeno mayor del polen de abedul, permite explicar esta asociación clínica. Un segundo panalergeno, la profilina, desempeña también un papel similar aunque con una menor prevalencia clínica²².
Sin embargo en los países del Sur de Europa, donde la alergia a polen de Fagales es prácticamente inexistente, se observa una elevada relevancia de alergia alimentaria a Rosáceas, principalmente melocotón, aparentemente no asociada a polinosis y con un perfil clínico mucho más severo²³.
En 1992, Lleonart et al²⁴ describen por primera vez una proteína de peso molecular entre 8 y 10 kDa, presente en la piel de melocotón y que es el alergeno mayoritario en una población española de alérgicos a dicha fruta, con clínica severa y sin asociación con polinosis. Posteriormente, en 1994, otro grupo²⁵ describe un componente de peso molecular similar que no es correactivo con ningún alergeno de polen de abedul y gramíneas, y que está presente en diferentes Rosáceas.
A pesar de esto, hasta 1999 no se produce la identificación de dicho alergeno. Prácticamente de modo simultáneo, Sánchez-Monge et al y Pastorello et al, identifican a las LTPs como los alergenos más relevantes en las poblaciones del Sur de Europa^26,27. El alergeno caracterizado en melocotón y manzana presenta un tamaño molecular de 9058 Da en manzana y 9138Da en melocotón y una movilidad electroforética en condiciones no reductoras correspondiente a 13 kDa.
A raíz de estos datos, se produce una explosión de trabajos científicos caracterizando nuevas LTPs alergénicas. Así, se describen LTPs en Rosáceas como albaricoque^{28, 29}, cereza³⁰ y ciruela³¹, con una elevada homología y reactividad cruzada con las LTPs de melocotón y manzana, y en otras especies vegetales como castaña³², Hevea brasiliensis³³, avellana³⁴, uva¹⁸, maíz¹⁹, lechuga³⁵o espárrago³⁶ (Fig. 2), tanto en alergias alimentarias como en enfermedades alérgicas ocupacionales.
Algunos alergenos descritos previamente como el alergeno de soja Gly m1, asociado a brotes epidémicos de asma por manipulación de haba de soja³⁷, están estrechamente relacionados con este grupo de proteínas.
Coincidiendo con la identificación de las LTPs como alergenos alimentarios y ocupacionales, se identifican LTPs alergénicas en distintos pólenes. Los alergenos mayoritarios de Parietaria Par j 1 y 2^{38, 39}, previamente caracterizados, se adscriben a dicha familia. Igualmente se identifican alergenos de la familia LTPs en polen de Artemisia (Art v 3)³² y de olivo (Ole e 7)^40,
41.
La reactividad cruzada entre LTPs de Rosáceas y de polen de Artemisia ha sido demostrada, tanto in vitro³² como in vivo⁴². Este hecho cuestiona el modelo de alergenos meramente alimentarios y plantea interrogantes sobre la sensibilización primaria en la alergia a LTPs y la posible relación entre polinosis a LTPs y alergia alimentaria.

4. Poblaciones y síntomas a LTPs: área mediterránea y reacciones sistémicas
La asociación alergia a LTPs-Sur de Europa es evidente. Fernández Rivas et al⁴³ han demostrado que la relevancia clínica a Rosáceas en España está asociada a Pru p 3. Según estos autores, el 76% de los pacientes con prueba cutánea y/o IgE específica tienen un test de provocación positivo. El 62% reconocía Pru p 3 frente a un 34% de positivos a profilina y un 7% a Bet v 1 (el homólogo de Mal d 1). La severidad clínica está asociada claramente a Pru p 3, el alergeno más relevante en la alergia a Rosáceas en la población española. La sensibilización a profilina no lleva asociada una clínica alimentaria significativa.
Sin embargo, los pacientes alérgicos a LTPs no presentan perfiles homogéneos. Por un lado, existen pacientes únicamente sensibilizados a LTPs de Rosáceas, incluso sólo a LTPs de melocotón. Por el contrario, otro grupo de pacientes presenta un elevado patrón de reconocimiento de LTPs, no únicamente de Rosáceas, sino de alimentos y pólenes⁴². La severidad de la sintomatología clínica que cursa frecuentemente con anafilaxia y la dificultad de prever cuántas LTPs son reactivas para un determinado paciente, hacen de esta población un grupo de pacientes con elevado riesgo.
En un estudio realizado en pacientes de Madrid y Murcia, se observaron importantes diferencias en cuanto a perfiles clínicos. En general, los pacientes de Murcia presentaban un patrón de reconocimiento más extenso que los de Madrid. La existencia de polinosis específicas asociadas a LTPs en Murcia⁴², principalmente Artemisia y Parietaria, nos hace evaluar el posible papel de la sensibilización inhalatoria a LTPs de pólenes como factor de riesgo en sensibilización alimentaria múltiple. Según este modelo, múltiples entradas a la familia, favorecerían un extenso reconocimiento alergénico de componentes de la misma.
Recientes trabajos (M. Lombardero et al; datos sin publicar) avalan esta hipótesis, habiéndose demostrado que la sensibilización primaria a Art v 3 de polen de Artemisia facilita la sensibilización a Pru p 3 de melocotón, al menos en un grupo de pacientes. La sensibilización a Par j 1 no parece jugar un papel similar, pero no se puede descartar que sea un factor de riesgo adicional.
Por otro lado, se ha descrito sensibilización inhalatoria a Pru p 3 de hojas de melocotonero como paso previo a la expresión clínica alimentaria al mismo⁴⁴.
La asociación a polinosis no parece ser el elemento clave en el patrón Sur de la alergia a LTPs, ya que la prevalencia de la sensibilización a las mismas es similar en diversas zonas geográficas de España, donde las polinosis relevantes son netamente distintas.
Una hipótesis interesante llevaría la asociación Sur-alergia a LTPs a los distintos patrones de consumo de Rosáceas. En los países del Sur de Europa se produciría una introducción en dieta más tardía y un consumo netamente estacional (Julio-Agosto), hecho éste que aumentaría el riesgo de sensibilización. En el Norte de Europa, el consumo mantenido de Rosáceas, principalmente manzana, y la menor influencia estacional favorecería la tolerancia, y la expresión clínica estaría asociada a la polinosis dominante (abedul).

5. Clonaje y mapeo epitópico de LTPs alergénicas
Se han obtenido clones cDNA correspondientes a algunos alergenos alimentarios pertenecientes a la familia de LTPs^{30, 45}, lo que ha permitido deducir sus secuencias aminoacídicas completas y expresar sus formas recombinantes en sistemas heterólogos eucarióticos (P. pastoris)⁴⁵ o procarióticos (E. coli)³⁰. En el caso de Pru p 3 se ha demostrado la equivalencia del alergeno natural y recombinante, tanto a nivel físico-químico como inmunológico (similar capacidad de ligar IgE, de activar basófilos y de inducir la liberación de histamina y sulfoleucotrienos)⁴⁶. rPru p 3 constituye, por tanto, una útil herramienta de diagnóstico en el caso de pacientes alérgicos a frutas de Rosáceas y, posiblemente también, a otros alimentos y pólenes que contengan LTPs alergénicas relacionadas.
La información sobre los epítopos B o T de alergenos alimentarios incluidos en la familia de LTPs es muy limitada. Sólo se han realizado estudios de este tipo en Pru p 3, utilizando un doble abordaje⁴⁷. El modelado tridimensional de la proteína ha permitido identificar residuos potencialmente implicados en el reconocimiento por anticuerpos (IgE), en particular las posiciones R39, T40, R44, K80 y K91. Los tres primeros residuos mencionados, que se localizan en el segundo giro y al inicio de la tercera hélice ( en la estructura terciaria (Fig. 3), han sido simultáneamente mutados, generando el triple mutante R39A/T40A/R44A. Dicho mutante muestra una drástica disminución en su capacidad de unir IgE (>60%) respecto a rPru p 3, lo que indica la importancia de un potencial epítopo IgE que incluiría esta parte de la molécula. Como aproximación complementaria, se han analizado péptidos sintéticos que cubren la secuencia completa de Pru p 3, localizándose epítopos IgE secuenciales en las regiones 11-25, 31-45 y 71-80. Un método similar aplicado al alergeno y LTP de látex Hev b 12, ha detectado las mismas zonas de secuencia (residuos 2-23, 27-46 y 71-80) como potenciales epítopos IgE⁴⁸.
Par j 1, el alergeno principal del polen de Parietaria judaica perteneciente a la familia de LTPs, ha sido clonado, expresado de forma recombinante en E. coli, y analizado a nivel de epítopos IgE⁴⁹. La región N-terminal de su secuencia (residuos 1-30) define un epítopo principal, que incluye dos residuos de Cys (C14 y C29, unidos por un puente disulfuro) y otras posiciones (K21, K23, E24 y K27) esenciales para la unión a IgE⁵⁰. Otras partes de la secuencia (residuos 18-37, 41-47, 72-79 y 118-125) también han sido detectadas como potenciales epítopos51. La divergencia de secuencia en todas estas regiones entre Pru p 3 y Par j 1 puede explicar, al menos en parte, la escasa reactividad cruzada que se ha encontrado entre ambos alergenos, tanto in vitro como in vivo (M. Lombardero et al; datos sin publicar).

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