SEGUNDA PONENCIA:
Implicaciones clínicas de la reactividad cruzada

MODERADOR:
Dr. Carlos Colás.
Hospital Clínico Universitario. Zaragoza.

Perfiles de sensibilización a polen de Salsola y de Chenopodium 
Mayte Villalba*, Rosalía Rodríguez*, Rodrigo Barderas*, Sara Abián*, Domingo Barber#, Carlos Colás &, Javier García Sellés§
*Universidad Complutense, Madrid. # ALK-Abelló. &Hospital Clínico Zaragoza. §Hospital Virgen de Arrixaca.

INTRODUCCION
Los pólenes de quenopodiáceas causan cada vez con más frecuencia alergia respiratoria, originando síntomas como rinitis y conjuntivitis. Aunque este tipo de plantas liberan bajas concentraciones de pólenes durante la polinización, en España son considerados importantes fuentes de sensibilización. Dentro de esta extensa familia, los miembros más relevantes desde un punto de vista alergénico, son el cenizo blanco o quenopodio (Chenopodium album) y la salsola (Salsola kali). 
A partir del complejo alergograma del extracto de quenopodio, tres alergenos han sido caracterizados, Che a 1, Che a 2 y Che a 3. El primero es un alergeno principal, con una prevalencia superior al 70%, aunque el porcentaje de IgE específica dirigida a él es muy bajo en la mayor parte de los pacientes, debido, en parte, a su baja concentración en los extractos. La profilina (Che a 2) y la polcalcina (Che a 3) son panalergenos con una incidencia variable según el área geográfica de la que proceden los pacientes, homólogos a proteínas de origen vegetal, bien pólenes o alimentos.
En zonas como Zaragoza donde la salsola es abundante, el número de sensibilizaciones a este polen es elevado y los alergogramas de pacientes alérgicos son más complejos que en Murcia, donde el quenopodio es una importante fuente de sensibilización, comparable a salsola. La prevalencia de algunos alergenos es variable según la distribución geográfica de la población alérgica, aumentando de forma notable la sensibilización a panalergenos, en Murcia, donde existen otros pólenes con alto contenido en proteínas homólogas, como el olivo. En ambas poblaciones, de manera más rotunda en Zaragoza, se ha detectado la aparición de bandas específicas en salsola, que no están presentes en quenopodio.

CLASES DE QUENOPODIACEAS
Las quenopodiáceas constituyen una familia de plantas perennes que pertenecen al orden de las Centrospermas, donde están incluidas más de 8.000 especies y que se encuentran ampliamente distribuidas en la naturaleza. Se distribuyen en dos subfamilias: Quenopodiáceas y Salsoloideas. Dentro de cada grupo, las especies más relevantes desde un punto de vista alergológico son el Chenopodium album y la Salsola kali (Figura 1).
El quenopodio sayón, armuelle blanco o cenizo blanco (Chenopodium album) es una cizaña anual de altura muy variable (20 a 120 cm). Sus hojas son aovadas o lanceoladas, a veces más o menos trilobuladas y sus flores se disponen en racimos cimosos densos. Su hábitat comprende cunetas, bordes de caminos, escombros, huertos poco cuidados y basureros; suelos que generalmente son ricos en sales y nitratos (es conocida por ser una planta halófila y nitrófila). 
Algunas especies están siendo utilizadas con fines ornamentales en jardines y en programas de fijación del suelo para frenar la erosión. Por este uso, y por su crecimiento descontrolado en vertederos y cunetas, se están originando altas concentraciones de polen que están contribuyendo a la inducción creciente de estas polinosis [1]. Otros miembros menos difundidos de las quenopodiáceas son Atriplex (escama), y la cultivada Beta (remolacha). 
El cardo ruso o salsola (Salsola kali) es el miembro más destacado, dentro de las consideraciones alergénicas de la familia de las Salsoloideas, existiendo una elevada correlación desde el punto de vista alergénico con las quenopodiáceas, dado entre otras cosas a su polen indistinguible desde un punto de vista óptico.

AEROBIOLOGÍA 
Morfología del polen 
Entre los alergenos de mayor incidencia clínica se encuentran los presentes en partículas fácilmente transportables por el viento. Las quenopodiáceas son plantas que polinizan de forma anemófila. 
Las estructuras y características del grano de polen de estas plantas [2] resultan indistinguibles a la visión óptica. Se trata de un polen reticulado y polipantoporado (múltiples poros), apolar, con simetría radial; circular. Posee un tamaño mediano (10-30 µm). La exina de 2 µm de grosor, con la sexina aproximadamente tan gruesa como la enexina. Su superficie es granulada, con gránulos irregularmente dispuestos.

Polinización y niveles de polen 
Las quenopodiáceas son plantas que florecen de Abril a Diciembre y poseen un periodo de polinización muy amplio, teniendo dos máximos en abril y a finales de agosto, principio de septiembre. En zonas como la costa levantina y Murcia los niveles pueden llegar a representar el 18% de la totalidad de los pólenes recogidos, aunque los valores medios suelen situarse en torno al 5%. Los niveles de polen obtenidos en el recuento polínico no suelen ser muy elevados (valores medios en torno a 50 granos/m3, aunque se pueden alcanzar máximos de 180 granos/m3). En el caso de la Península Ibérica, la sensibilización al polen de quenopodio, medida por prueba cutánea, es más frecuente en la zona Mediterránea y zona Sur [3], donde puede llegar a afectar hasta a un 34,5 % de la población. En el resto del país el porcentaje varía desde un 0% en las Islas Canarias a un 9,1% en Castilla-La Mancha. 
El polen de Salsola kali constituye una de las principales fuentes de sensibilización en Zaragoza [4], ocupando el segundo lugar en importancia (40% de los polínicos) a diferencia del resto del resto de España donde no llega al 10%. Hay que destacar que la Salsola es una planta muy resistente a la sequía y se da en áreas semidesérticas con una frecuencia baja de lluvias: el Valle del Ebro y el área de confluencia entre Albacete, Almería y Murcia. Por tanto es importante considerar que las diferencias entre años lluviosos o secos y la creciente desertización de muchos países, concretamente España, podría afectar notablemente a las diferencias en los recuentos.
Fuera de la Península Ibérica, en países como Kuwait, Arabia Saudí, y el Oeste de Estados Unidos, el polen de quenopodiáceas es considerado como la fuente alergénica más relevante [5].

COMPOSICIÓN ALERGÉNICA
Clínicamente se han descrito sensibilizaciones a Beta vulgaris, Chenopodium album y Salsola kali, incluso se conocen las áreas de predominio de estos pólenes pero hasta unos pocos años atrás poco se conocía acerca de sus paneles alergénicos y ningún alergeno de quenopodio había sido caracterizado.
De la experiencia de los grupos clínicos en sus análisis de las pruebas cutáneas llevadas a cabo en los pacientes se ha establecido un alto grado de reactividad cruzada entre los pólenes de quenopodio y salsola [6], dado que existe, en pacientes sensibilizados a estos pólenes, un grado de correlación de un 94 % en pruebas cutáneas y un 70-90 % en RAST.
Uno de los más importantes aspectos de la alergia a estos pólenes, es el complejo alergograma obtenido tras la inmunotransferencia de las proteínas del extracto proteico a membranas y detección con las IgE de sueros individuales de pacientes alérgicos. En el de quenopodio destacan bandas alergénicas de masas moleculares comprendidas entre 50 y 9 kDa (Figura 3), con dos intervalos 35-50 kDa y 9-20 kDa. 
El patrón alergénico de salsola es también complejo pero si se comparan los patrones alergénicos que existen en salsola y quenopodio, se pueden observar diferencias desde un punto de vista cualitativo; existen bandas alergénicas en un polen no presentes en el otro; y cuantitativo, la frecuencia de reconocimiento de algunas de las bandas, por ejemplo las de bajo peso molecular, es muy dispar en ambos pólenes.
Independientemente de la eterna discusión acerca de los inconvenientes o ventajas que supone la utilización de los alergenos en su forma recombinante o natural, resulta indiscutible que los distintos alergenos representados en los extractos utilizados poseen concentraciones, estabilidad e incluso conformación muy diferentes lo que sin duda originará, en algunos casos, resultados muy discrepantes en el diagnóstico y sobre todo en la eficacia en la terapia de los pacientes alérgicos. En la actualidad no cabe la menor duda de que la diagnosis y sobre todo la inmunoterapia requieren un completo conocimiento de las moléculas responsables de los procesos alérgicos y para ello es imprescindible aislar y caracterizar los alergenos más importantes de una determinada fuente sensibilizante. En definitiva conviene conocer el panel alergénico completo.
Un problema adicional que se ha puesto de manifiesto recientemente, sobre todo en los pacientes polínicos, es la variabilidad en la prevalencia de los alergenos dependiendo de un amplio número de factores. Quizás sea la localización geográfica en la que vive un determinado individuo alérgico, una de las circunstancias que más pueden hacer variar el patrón alergénico. Ya que de ella deriva el hecho de que se alteren los niveles de polen a los que se exponen los pacientes y el que varíe el número y el tipo de sensibilizaciones a otras especies. 

ALERGENOS EN CHENOPODIACEAS
La alergia al polen de quenopodiáceas, con una incidencia entre la población alérgica claramente ascendente, ha constituido hasta hace relativamente poco, una auténtica desconocida en cuanto a la elucidación de sus componentes alergénicos. Aquí vamos a tratar de presentar un análisis detallado de aquellos alergenos más importantes en este polen. A lo largo de este análisis debemos tratar de contestar a algunas preguntas que se deducen de los planteamientos expuestos: ¿Cuántos alergenos relevantes constituyen el panel alergénico del polen de quenopodiáceas? ¿Existen alergenos específicos para cada una de las fuentes principales, salsola y quenopodio, implicando por tanto la existencia de sensibilizaciones específicamente dirigidas hacia alguna de esas fuentes en determinados pacientes? o por el contrario, ¿son debidas las diferencias en los valores de IgE encontradas solamente a un problema de niveles?. ¿Podemos asociar los altos niveles de un polen o el alto número de polisensibilizaciones en una población con una alta prevalencia de determinados panalergenos? 
Los estudios sobre alergenos particulares del polen de quenopodiáceas son recientes en la literatura y desde el año 2001 se han descrito y caracterizado tres alergenos del polen de Chenopodium album, Che a 1, Che a 2, Che a 3.

Alergeno más prevalente: Che a 1.
El abordaje del aislamiento y la caracterización del primer alergeno analizado del polen de quenopodio, se basó en la observación de un paralelismo entre la sensibilización a Ole e 1 en pacientes alérgicos al polen de olivo y la alergia a quenopodiáceas. Además en las inmunotransferencias de muchos de los sueros analizados aparecían bandas proteicas de alrededor de 20 kDa. Eso nos hizo pensar que podía existir en estos pólenes un miembro más de la familia de las proteínas homólogas a Ole e 1, entre los que ya se habían descrito algunos alergénicos en gramíneas (Lol p 11) y malezas (Pla l 1). Por tanto, mediante un antisuero policlonal específico del alergeno de olivo Ole e 1 se llevó a cabo la detección de esta proteína en el extracto de Chenopodium album. Es una glicoproteína con una masa molecular de 18.8 kDa y tras su caracterización fue denominado Che a 1 [7]. Su patrón electroforético difiere notablemente del de su homólogo en el olivo. En lugar de ser una proteína mayoritaria y un complejo patrón electroforético, Che a 1 se comporta como una única banda glicosilada presente en muy bajas concentraciones en el extracto. El alergeno se ha expresado en la levadura Pichia pastoris y secuenciado, obteniéndose su estructura primaria que consiste en una cadena polipeptídica de 143 aminoácidos con una masa molecular de 15.8 kDa y con un sitio de glicosilación en la Asn-39, posición que es coincidente exclusivamente con su homónimo en tomate (Lycopersicon esculentum). Che a 1 posee un bajo grado de identidad del 30 % con Ole e 1 y del 42 % con Lol p 11, comprobándose nuevamente que sólo aquellos miembros de esta familia que pertenecen a especies relacionadas taxonómicamente poseen estructuras primarias muy similares (superiores al 80%). Este escaso porcentaje de equivalencia podría explicar la baja reactividad cruzada entre Che a 1 y Ole e 1. El que se trate de una glicoproteína y la baja heterogeneidad presente entre los carbohidratos de proteínas vegetales, podría explicar, no obstante, algunas reactividades cruzadas detectadas en determinados pólenes.
Aunque la prevalencia de Che a 1 varía dependiendo del área geográfica, en prácticamente todas las poblaciones es considerado un alergeno principal, atendiendo a su incidencia en la población alérgica que suele ser superior al 50%. Un alergeno principal es, desde un punto de vista alergológico, aquel que es reconocido por más del 50 % de los pacientes que se han sensibilizado a esa fuente biológica. Pero no cabe duda que además de una alta prevalencia, para que el alergeno sea realmente relevante es necesario que tenga un título alto de IgE específica. Esta potencia inmunológica suele ir asociada con el hecho de ser proteínas mayoritarias en el contenido proteico de los extractos. En este caso, Che a 1 en el extracto de quenopodio se encuentra en muy baja concentración a diferencia de su homólogo Ole e 1 y los niveles de IgE dirigidas a esta proteína son muy bajos luego podemos aventurar que Che a 1 es un alergeno principal con capacidad inmunogénica alta capaz de desencadenar la unión de IgE pero con poca relevancia clínica.

Panalergenos: Che a 2, Che a 3.
Las profilinas son moléculas muy ubicuas encontradas en un gran número de especies vegetales y animales. Unen polímeros de actina y están implicadas en transducción de señales en las rutas de fosfoinosítidos. Son consideradas como panalergenos [8] presentes en muchas fuentes biológicas con un alto grado de identidad en su estructura primaria. La profilina aislada a partir de quenopodio es una proteína ácida (pI 5.2) que posee una masa molecular de 12.6 a 15.2 kDa, lo que parece estar de acuerdo con su carácter polimórfico. 
Che a 2 ha sido clonado y secuenciado y está compuesto por una cadena polipeptídica de 131 residuos aminoacídicos. La comparación de las distintas isoformas permite observar la gran diferencia existente entre las zonas N-terminales de las distintas isoformas, donde se aprecian no sólo heterogeneidades en la secuencia sino la ausencia de varios aminoácidos. Esto explicaría la amplitud de la banda observada en PAGE-SDS. Curiosamente cuando se compara la secuencia de esta proteína con las de otras profilinas de origen vegetal se observa una mayor similitud con la de látex (94%) y alimentos como la manzana (93%) que con las de otros pólenes como olivo (88%) y abedul (87%) [9]. Esta proteína ha sido expresada en bacterias y es producida recombinante en el mismo sistema heterólogo con un alto rendimiento.
La prevalencia obtenida para Che a 2 en pacientes del área de Madrid y Jaén oscila alrededor del 55 %. Sin embargo la existente en las regiones de Zaragoza y Murcia es de 14 y 20 % respectivamente. Los valores de prevalencia dados para las profilinas de pólenes entre los pacientes alérgicos están alrededor del 20% en alérgicos a abedul y artemisia. Valores más altos y variables se han obtenido para olivo (24-40%), dependiendo los valores de la zona de procedencia de los pacientes. 
La actividad bioquímica de una proteína es uno de los principales rasgos que la definen y va a permitir conocer su comportamiento. Che a 3, un nuevo alergeno del polen de quenopodio, es una proteína que une calcio [10] mediante dos sitios de unión. Es una proteína pequeña con un peso molecular aparente de 9.8 kDa y un punto isoeléctrico ácido (pI 4.4) que se obtiene con un rendimiento de 60?g/g de polen. Posee una cadena polipeptídica de 86 residuos, con una gran similitud con proteínas homólogas de otros pólenes y que ha sido producida recombinante en E. coli. 
La prevalencia de este alergeno experimenta dramáticos cambios en distintas áreas geográficas variando desde un 3% al 55%. 

PATRONES DE RECONOCIMIENTO EN DISTINTAS ÁREAS GEOGRÁFICAS 
La variabilidad alergénica en las reactividades de los pacientes de distinta procedencia geográfica hacia una determinada fuente ha sido demostrada frecuentemente, sobre todo en el caso de los pólenes. La prevalencia de determinados alergenos cambia de forma notable dependiendo de factores como el clima, la abundancia de la planta en una determinada área, la presencia de otros pólenes, etc. Eso complica extraordinariamente el diagnóstico preciso de un paciente y la aplicación de una terapia eficaz.
Veintiocho sueros de pacientes procedentes de la provincia de Murcia y 29 de Zaragoza han sido testados en ELISA para determinar la IgE específica frente a los extractos de quenopodio y salsola observándose valores muy dispares en la sensibilización a ambos pólenes ya que mientras el 55% de los pacientes de Zaragoza están sensibilizados casi exclusivamente frente a salsola con valores de IgE específica muy elevados, siendo apenas apreciables los valores de IgE específica para quenopodio, ese porcentaje desciende a un 30% en los pacientes de Murcia. En los alergogramas de quenopodio de la población de Zaragoza existe un menor número de bandas alergénicas de bajo peso molecular que en la población de Murcia, bandas que corresponden con un alta probabilidad a los panalergenos Che a 2 y Che a 3. En los paneles correspondientes a quenopodio existen bandas a la altura de 18 kDa que corresponderían al alergeno Che a 1, reconocido por un mayor número de sueros en Murcia. El hecho de disponer de los alergenos purificados nos ha permitido llevar a cabo la búsqueda de sensibilizaciones en sueros individuales. La prevalencia entre los pacientes de Zaragoza es del 69% a Che a 1, un 20.1% a Che a 2, el 3.4% a Che a 3 y el 75% a la 1,3-?-glucanasa purificada a partir del polen de olivo. En esta población seleccionada los pacientes están sensibilizados a otros pólenes fundamentalmente gramíneas (55%), llantén (45%), cupresáceas (34%), artemisia (31%) y olivo (27%).
Los pacientes de Murcia exhiben un 82.2 % a Che a 1, el 14.3% a Che a 2, un 32% a Che a 3 y un 100% a la 1,3-?-glucanasa (Figura 4). Estos pacientes son polisensibles a olivo (75%), gramíneas (57%), parietaria (50%), artemisia (36%). 
Las conclusiones que se deducen de estos resultados son: a) La mayoría de los pacientes alérgicos a quenopodiáceas están sensibilizados a otros pólenes; b) la sensibilización a salsola es mucho más relevante que al quenopodio en ambas regiones pero esas diferencias están mucho más marcadas en Zaragoza pudiendo ser considerado como el sensibilizador primario; c) en regiones como Murcia donde existen altos niveles de exposición a quenopodio, se incrementan las sensibilizaciones a Che a 1, alergeno específico y a panalergenos, especialmente Che a 3, bien por aumento en los niveles de polen y/o por la aparición de reactividades cruzadas con alergenos de otros pólenes abundantes en la zona y relacionados como el olivo [11]. En polínicos sin ir más lejos, a medida que aumentan los niveles de polen a los que está expuesto un paciente aumenta la frecuencia de reconocimiento de alergenos menores mientras que a bajos niveles de exposición, son los alergenos mayores los que predominan como fuente sensibilizante.

NUEVOS ALERGENOS EN EL EXTRACTO DE SALSOLA KALI
La comparación de los pacientes alérgicos seleccionados en provincias en los que estos pólenes tienen una especial relevancia, permite destacar dos aspectos importantes: en primer lugar existe un porcentaje realmente elevado de ellos que son alérgicos exclusivamente a salsola, poseyendo valores de IgE específica negativos a quenopodio, en segundo lugar, esas diferencias son más marcadas en los pacientes seleccionados en Zaragoza (Figura 5). 
En los alergogramas de estos pacientes sobre extractos de salsola, tanto de Zaragoza como de Murcia, se pueden detectar bandas específicas, sobre todo una de 43 kDa de carácter glicoproteico, mayoritaria en el extracto, que ya había sido descrita en 1981 por Shafiee y col. [12] y que es reconocida por más del 50 % de los pacientes. Además existen otras bandas de 30 kDa y de 10 kDa. Una proteína específica de este polen ha sido descrita por Carnés y col. [13], ha sido purificada y segmentos de su estructura primaria secuenciados. La secuencia de tres péptidos de la molécula ha permitido asignar el nombre de Sal k 1 al primer alergeno identificado en el polen de Salsola kali. Este alergeno puede ser considerado probablemente como alergeno específico y relevante de salsola.

CONCLUSIONES
* Los extractos de Salsola kali y Chenopodium album exhiben diferencias significativas en su composición alergénica, cuantitativamente, en cuanto a los niveles de alergenos comunes, y cualitativamente, en cuanto el tipo de proteínas.
* En Zaragoza la mayor parte de los pacientes alérgicos a quenopodiáceas lo son a salsola, siendo extremadamente baja la sensibilización a quenopodio.
* Aunque una mayoría de los sueros de los pacientes alérgicos a salsola poseen IgE para un alergeno de 43kDa, en Zaragoza donde los pacientes poseen niveles muy elevados de IgE específica para salsola, aumenta el número de otras bandas alergénicas específicas distintas.
* En Murcia se eleva considerablemente el número de pacientes sensibilizados a quenopodio, incrementándose concomitantemente la prevalencia de panalergenos, como la polcalcina Che a 3.


BIBLIOGRAFÍA
1.- Lombardero M, Duffort O, Carreira J. Allergenic significance of chenopod pollen; in D'Amato G, Spieksma FTM, Bonini S (eds): Allergenic Pollen and Pollinosis in Europe. Oxford, Blackwell, (1991), pp 128-131.
2.- Homan RB. Lamb's quarters pollen. Ann Allergy (1963) 21:647-649.
3.- Galán C, Infante F, Ruiz de Clavijo RC, Guerra F, Miguel R, Domínguez E. Allergy to pollen grains from Amaranthaceae and Chenopodiaceae in Córdoba, Spain:Annual and daily variation of pollen concentration.Ann Allergy (1989) 63: 435-437.
4.-Pola J., Zapata C. y Sanz E. Polinosis en el área de Zaragoza. Rev. Esp. Alergol. Inmunol. Clin. (1998) 2: 135-139.
5.- Wurtzen PA, Nelson HS, Lowenstein H, Ipsen H. Characterization of Chenopodiales (Amaranthus retroflexus, Chenopodium album, Kochia scoparia, Salsola pestifer) pollen allergens. Allergy (1995) 50: 489-497.
6.- Lombardero M, Duffort O, Sellés JG, Hernández J, Carreira J. Cross-reactivity among Chenopodiaceae and Amaranthaceae. Ann Allergy (1985) 54: 430-436.
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8.- Valenta R, Duchêne M, Ebner C, et al. Profilins constitute a novel family of functional plant pan-allergens. J Exp Med (1992) 175: 377-385.
9.- Barderas R, Villalba M, Batanero E, Pascual CY, Rodríguez R. Role of profilin and polcalcin in chenopod pollen allergy. J Allergy Clin Immunol (2003) 111:1132-1133.
10.- Profilin (Che a 2) and polcacin (Che a 3) are relevants allergens of Chenopodium album pollen. Isolation, amino acid sequences and immunological properties.
11.- Florido JF, Quiralte J, Saénz de San Pedro B, Bartolomé B. Cross-reactivity between Olea europaea and Chenopodium album pollens. Allergy (2000) 55(sup 63): 158.
12.- Shafiee A, Yunginger JW, and Gleich GJ. Isolation and Characterization of Russian thistle (Salsola pestifer) pollen allergens. J Allergy Clin Immunol (1981) 67:472-81.
13.- Carnés J, Fernández-Caldas E, Marina A, Lahoz C, Colás C, Lezaun A. Immunochemical characterization of Russian thistle (Salsola kali) pollen extracts. Purification of the allergen Sal k 1. Allergy (2003)58:1152-1156.