SEGUNDA PONENCIA:
Implicaciones clínicas de la reactividad cruzada

MODERADOR:
Dr. Carlos Colás.
Hospital Clínico Universitario. Zaragoza.

Perfiles de sensibilización a polen de olivo. Implicaciones clínicas.

Dr. Fernando Florido.
Complejo Hospitalario de Jaén.
Jaén.

El olivo (Olea europaea) es un árbol originario de Asia Menor que desde hace mas de 5000 años se cultiva en todo el área mediterránea donde ha alcanzado gran importancia económica por su fruto, la aceituna, y el aceite que de ella se extrae. O. europaea pertenece a la familia botánica Oleaceae, la cual comprende 29 géneros, de los cuales sólo seis tienen interés económico u hortícola (1). Cuatro de ellos son cultivados con propósitos ornamentales o alimentarios: Olea (Olivo), Ligustrum (Aligustre), Jasminum (Jazmín) y Syringa (Lila) y otros dos crecen de forma silvestre Fraxinus (Fresno) y Phyllyrea (Agracejo) .
El cultivo del Olivo en España, se extiende por todas las regiones a excepción de la zona norte, donde su presencia es testimonial, pero a pesar de su extensión, el olivo se concentra mayoritariamente en Andalucía con casi el 60% del total de hectáreas cultivadas. En algunas comarcas de Andalucía, como por ejemplo la Provincia de Jaén, el olivo domina la tierra agrícola en detrimento de otros cultivos como los cereales que antaño tenían una importante representación, especialmente en las zonas limítrofes de la depresión del Guadalquivir o cultivos de regadío en torno a los valles fluviales (2). Sin embargo, la mayor rentabilidad del olivar animada por una política subsidiaria proveniente de la Comunidad Europea ha contribuido y continúa haciéndolo, al incremento espectacular de éste frente a otros tipos de cultivos. 

1. Aspectos clínicos de la polinosis por Olea europaea
La polinización del olivo se realiza por insectos (entomófila), pero existe una importante polinización secundaria por el viento (anemófila) cuando la producción de polen es abundante. 
En la familia Oleaceae, el polen mas alergénico es el producido por Olea europaea que en la zona mediterránea suele estar presente en el aire en los meses de mayo y junio. No obstante la polinización del olivo está influenciada por sus variedades, factores climáticos y geográficos aunque para una zona determinada su duración no va mas allá de un mes (3). Figura 1. 
Es frecuente encontrar en la literatura una mayor prevalencia de sintomatología nasal y conjuntival causada por O. europaea, pero este polen también es capaz de inducir sintomatología bronquial, incluso de intensidad moderada y en ocasiones grave, que en zonas como Jaén llega a padecerla mas del 60% de la población sensibilizada (4,5).
En un estudio ya clásico, Davies y Smith (6), demostraron que concentraciones más altas de 50 granos/m3 de polen de gramíneas podían ser consideradas altas y por tanto capaces de desencadenar síntomas en pacientes sensibles a este polen. Con una metodología similar, se investigó en Jaén el nivel umbral de la concentración de polen de olivo necesario para producir sintomatología nasal y/o conjuntival en pacientes monosensibilizados. Tras obtener una buena correlación entre la puntuación media de los síntomas y el recuento diario de polen de olivo en los dos años que duró el estudio (1994: r=0.8463 p<0.001; 1995: r=0.8366 p<0.001) se encontró que eran necesarios alrededor de 400 granos/m3 de polen de O. europaea para que la mayoría de pacientes sufran, al menos, sintomatología naso-ocular de intensidad leve (7). Figuras 2 y 3.
Estas observaciones clínicas realizadas durante la exposición natural a polen de olivo, son compatibles con otras extraídas durante la exposición controlada en el test provocación bronquial especifica (TPBE).
En 1996, durante el desarrollo de un estudio para evaluar la eficacia de la Inmunoterapia Especifica (ITE) con un extracto de Olea estandarizado biológicamemente (8), pudimos observar que durante el TPBE con Olea europaea, en aproximadamente la mitad de los casos aparecía una respuesta dual. Además, la intensidad de la fase tardía estuvo estrechamente relacionada con la intensidad del asma bronquial observada durante el periodo primaveral, siendo más intensa cuanto más gravedad presentaba el asma estacional.
Por otro lado, también observamos, que en aquellos pacientes que recibieron ITE, la PC20 pasó de 9,20 a 50,2 BU/ml tras dos años de tratamiento. Reduciéndose casi a la mitad la frecuencia de aparición de reacción tardía en el TPBE.

En nuestro área, la alergia al polen de olivo es la principal causa de polinosis. La monosensibilización a este polen es rara (menos del 15 % de casos), siendo más frecuente la sensibilización concomitante con polen de Gramineae y Chenopodiaceas.

2. Alergenos de polen de olivo.
La respuesta inmunológica al extracto completo del polen de olivo es muy heterogénea, observándose al menos 20 bandas de diferente peso molecular aparente, las cuales se han caracterizado parcialmente a lo largo de estos 10 últimos años, desde la observación inicial de Lauzarica et al (9,10,11,12) en la que se identificaban bandas en el immunoblotting entre 17 y 62 kDa. La evaluación de cada alergeno se establece en términos de análisis de estructura y secuenciación, estudio de la probable función biológica y actividad inmunológica in vitro y, si es posible, in vivo (13). Tabla I.

3. Aspectos genéticos de la respuesta inmune fente al polen de olivo.
Desde hace años, se han realizado estudios tanto familiares como de casos/control para examinar la relación existente entre haplotipos HLA y la atopia. Los antígenos HLA-DR, DQ y DP, constituyen un grupo candidato obvio al desarrollar una función clave en la presentación de péptidos extraños a los linfocitos Th, estando localizados los genes que los codifican en la región cromosómica 6p 21.3.
En la respuesta a alergenos de polen de olivo, se ha encontrado (14) una fuerte asociación entre la respuesta de anticuerpos IgE específicos frente al alergeno mayoritario Ole e 1 y los antígenos HLA de clase II DRB1*07/DQB1*0201 estimando un Riesgo Relativo de 4.56 y una fracción etiológica de 0.53 para DR7 y para DQ2 un Riesgo Relativo de 9.73 y una Fracción Etiológica de 0.81.
Los antígenos DR7 y DQ2 poseen un fuerte desequilibrio de ligamiento (se expresan juntos con una frecuencia muy elevada), motivo por el que no se puede concluir si el responsable del riesgo genético para la enfermedad es alguno de los dos antígenos por separado o el binomio DR7-DQ2.
La asociación con DQ2 (71,4%) en la respuesta positiva a Ole e 1, supuso un cambio respecto al papel de los genes HLA-DQ en la respuesta alérgica ya que fue la primera vez que se describió esta asociación , que en estudios posteriores parece mas fuerte que la DR7 (42.8%).
El conocimiento de la estructura primaria de le e Ooooo Ole e 1 y su posterior clonaje y expresión en E. Coli, posibilitó la investigación de la respuesta proliferativa de células mononucleares frente a péptidos sintéticos de Ole e 1 en pacientes alérgicos a este alergeno y con ello establecer los epítopos inmunodominantes de Células T.
El grupo del Dr. Lahoz encontró que este tipo de respuesta inmunológica arrojaba importantes diferencias entre ambos grupos, estando presente en el 71.4% de los pacientes alérgicos a Ole e 1 y sólo en el 25% de los no alérgicos. A pesar de que el número de péptidos utilizados en el ensayo fue similar en ambos grupos, en los pacientes alérgicos se observó que la respuesta de células T se dirigía fundamentalmente frente a tres péptidos de la región carboxilo-terminal de la molécula de Ole e 1, siendo además el 70% de estos pacientes portadores del antígeno DQ2 (15)
Sin duda alguna, el análisis de los factores de restricción en la respuesta mediada por IgE frente a los alergenos del polen de olivo, van paralelos al proceso de caracterización de cada uno de ellos, y de la disponibilidad de uso en los sujetos clínicamente sensibles a Olea europaea. Probablemente las asociaciones genéticas que regulan la respuesta mediada por IgE frente a alergenos purificados de Olea europaea se evidencien con mayor facilidad, que frente al extracto completo del material alergénico, aunque este proceda de la misma fuente como sucede con el polen de olivo.
En este sentido, se analizó la restricción genética para dos alergenos del polen de olivo (Ole e 1 y Ole e 3) (16) y para ello, se seleccionaron en La Unidad de Alergia del Complejo Hospitalario de Jaén a 22 familias de pacientes alérgicos a Olivo, con la condición de que al menos dos hijos de cada familia fuesen alérgicos y al menos uno de los padres no lo fuera. En este estudio, una vez mas se demostró la asociación con los antígenos DRB1*07 y DQB1*0201. En concreto, para el primero (DR7) la asociación mas fuerte se encontró con altos niveles de IgG frente a Ole e 1 (p=0.025) y para el segundo (DQ2) con niveles altos de IgG (p=0.023) e IgE (p=0.013) frente a Ole e 1 así como nivel alto de IgE anti Ole e 3 (p=0.036).
En resumen, los resultados de todos los estudios genéticos sobre pacientes alérgicos al polen de olivo demuestran claramente la asociación con DR7-DQ2 pero al mismo tiempo sugieren la implicación de múltiples influencias genéticas. Desde el mismo momento en que ya conocemos un gran número de alergenos de este polen, futuras investigaciones especialmente centradas en la exacta descripción de las regiones inmunodominantes de células T y B de la molécula de cada uno de estos alergenos, facilitarán en gran medida el conocimiento de los mecanismos inmunológicos implicados.

4. Implicaciones clínicas de los conocimientos actuales acerca de los alergenos del polen de olivo. 
Respuestas IgE específicas frente a alergenos del polen de olivo en pacientes con polinosis.
En los últimos años, diferentes estudios realizados en pacientes alérgicos a polen de olivo, demuestran una gran diversidad de alergogramas con diferentes patrones de fijación de IgE específica cuando sus sueros son analizados de forma individualizada, arrojando por tanto diferentes frecuencias de sensibilización para cada alergeno.
No obstante, estas frecuencias de sensibilización han sido obtenidas analizando sueros que proceden de pacientes de diferentes áreas geográficas con distinta exposición alergénica y escasa caracterización clínica: p.e. Tipo e intensidad del sindrome alérgico y/o asociación con otras condiciones atópicas. Por ello, nuestro grupo diseñó un estudio para evaluar la actividad inmunológica de algunos alergenos purificados del polen de olivo en una población de pacientes polínicos expuestos a altas concentraciones de este polen, utilizando tanto métodos in vivo como in vitro (17).

MATERIAL Y METODOS
Se incluyeron 119 pacientes que cumplían los siguientes criterios: 1) rinitis y/o asma bronquial durante el periodo de finales de abril a junio. 2) Prick-Test positivo con el extracto completo de Olea europaea y 3) que no hubiesen recibido inmunoterapia especifica con extracto de olivo. 
Prick-test: Se realizaron con 5 alergenos de polen de olivo Ole e 1, 2, 3, 6 y 7. Los Prick-test, se realizaron tambien, con un panel de alergenos comunes que incluía: Dermatophagoides Pteronyssinus, Cucaracha germánica, epitelios de perro y gato, Alternaria, Aspergillus y Cladosporium, Lolium, Cynodon, Cupresus sempervirens, Platanus, Artemisia, Chenopodium, Salsola kali y Parietaria judaica. 
La determinación de la IgE específica se realizó mediante ELISA.

RESULTADOS
Tanto Ole e 1 como Ole e 2 pueden ser considerados en nuestra población como alergenos mayoritarios. Para Ole 6 y 7 la frecuencia de sensibilización en ambos casos se sitúa en el 47, 9% y baja al 37,8 % para Ole e 3. Figura 4. La expresión clínica de estas sensibilizaciones a nivel respiratorio se traducía en R+AB en el 78,4% de los casos y sólo en R en el 25,2 %
Los pacientes con sensibilizaciones a otros pólenes tuvieron niveles significativos de IgE específica para Ole e 2, 3, 6, y 7, en cambio Ole e 1 no estuvo significativamente asociado con otras polinosis.

VALOR DIAGNOSTICO DEL PRICK-TEST CON ALERGENOS DEL POLEN DE OLIVO
En nuestra población se describen hasta 77 combinaciones diferentes de positividad de 1 a 5 alergenos de polen de olivo. El 54,6% presenta un perfil de sensibilización que implica a tres de los mismos.
En cuanto al valor diagnóstico de estas combinaciones, podemos observar que la combinación de Ole e 1 y 2 con Ole e 6 o 7 alcanza una sensibilidad y especificidad del 100%; es decir que utilizando sólo 3 alergenos se obtiene el mismo resultado que al usar el extracto completo de polen de olivo. Figura 5.
Ole e 2 pueden considerarse 
Un alergeno del polen de olivo (Ole e 7) está asociado con anafilaxia por alimentos de origen vegetal.
Otro ejemplo de la utilidad clínica de los conocimientos actuales acerca de los alergenos del polen de olivo, lo tenemos en el estudio de los síndromes polen-frutas los cuales se sustentan en la homología de las proteinas presentes en ambas fuentes alergénicas.
Nosotros, hemos evaluado en pacientes alérgicos a frutas o frutos secos, el perfil de sensibilización a alergenos del polen de olivo y además hemos investigado si la expresión clínica de la alergia alimentaria SAO (Síndrome de alergia oral) o anafilaxia se asocia con alguno de estos alergenos (18).

MATERIAL Y METODOS
Estudiamos a 134 pacientes derivados a la Unidad de Alergia del Hospital Ciudad de Jaén por presentar de forma estacional, rinitis y/o asma bronquial durante los meses de abril a junio.
Todos tienen Prick-test positivo a olivo, y dependiendo además de si habían presentado algún tipo de reacción adversa (RA)con alimentos de origen vegetal y la intensidad de la misma fueron asignados a uno de los tres grupos siguientes: Figura 6.
GRUPO A: 21 pacientes con síntomas compatibles con SAO el cual fue confirmado por al menos una provocación oral doble ciego controlada con placebo (PODCCP) positiva con alguna fruta perteneciente a las familias Rosacea (melocoton o pera), cucurbitacea (melón) o actinidiacea (kiwi).
GRUPO B: en este grupo se incluyeron 19 pacientes con historia clínica compatible con anafilaxia desarrollada tras la ingestión de frutas pertenecientes a las familias antes citadas o frutos secos y cuya sensibilización fue confirmada mediante Prick-test.
GRUPO C: 94 pacientes alérgicos a polen de olivo, sin antecedentes de RA con alimentos vegetales y Prick-test sistemáticamente negativo para frutas y frutos secos.
METODOS: Realizamos pruebas cutáneas (Prick-Test) con los alergenos naturales purificados de polen de olivo Ole e 1, 2, 3, 6, 7 y la forma recombinante del Ole e 8. Se testaron también, los extractos comerciales de almendra, cacahuete, nuez, y avellana y mediante prick-prick: melocotón, pera, melón y kiwi.
La PODCCP se realizó en aquellos pacientes que referían en la anamnesis síntomas compatibles con alergia oral provocados por al menos una de las frutas seleccionadas para este estudio. 

RESULTADOS
Todos los pacientes estaban sensibilizados al extracto completo de polen de olivo y al menos a uno de sus alergenos. Unicamente resultó significativa la asociación entre sensibilización al alergeno purificado Ole e 7 y la anafilaxia como expresión clínica de la alergia a frutas. Tabla II.
En el grupo A de pacientes, aquellos con SAO como manifestación clínica de su alergia a frutas, el resultado positivo de la prueba de provocación coincidió con la positividad del prick-test en mas del 50% de los casos independientemente de la fruta testada. En este grupo no encontramos ninguna asociación significativa entre la presencia de sensibilización a frutas clinicamente manifiesta como SAO y sensibilización a alergenos de polen de olivo, en especial a la profilina del polen de olivo, Ole e 2. Figura 7.

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