SEGUNDA PONENCIA:
Implicaciones clínicas de la reactividad cruzada

MODERADOR:
Dr. Carlos Colás.
Hospital Clínico Universitario. Zaragoza.

Acaros. Reactividad cruzada y relevancia clínica
Dr. Manuel Lombardero.
Departamento de Investigación y Desarrollo. Laboratorio ALK-Abelló. Madrid.

RESUMEN
El objetivo de este trabajo fue determinar las especies de ácaros mayoritarias en muestras de polvo doméstico de pacientes de la provincia de Huelva con historia clínica sugerente de alergia a ácaros. También se realizó un estudio de reactividad cruzada entre las especies relevantes.
El ácaro mayoritario, aparte de D. pteronyssinus, fue G. domesticus, seguido de T. putrescentiae y L destructor. Aproximadamente la mitad de los pacientes con exposición a G. domesticus estaban sensibilizados "in vivo" a este ácaro, lo que supuso aproximadamente el 25% de la muestra original.
La valoración de IgE específica y experimentos de RAST de inhibición indicaron la ausencia de reactividad cruzada entre D. pteronyssinus y G. domesticus, L. destructor y T. putrescentiae. Sin embargo se detectó una importante reactividad cruzada entre G. domesticus y L. destructor (>80%). Estos resultados indican que tanto G. domesticus como L. destructor pueden actuar como sensibilizantes primarios de modo independiente a D. pteronyssinus. En T. putrescentiae se observó una reactividad cruzada parcial (<50%) con G. domesticus y L. destructor; y que no estaba actuando como sensibilizante primario, a pesar de que estaba presente en aproximadamente el 50% de los domicilios con G. domesticus. Es muy probable que los alergenos grupo 2, es decir, Gly d 2, Lep d 2 y Tyr p 2 estén involucrados en esta reactividad cruzada.
A la vista de estos resultados, la incorporación de G. domesticus en la batería diagnóstica y en el tratamiento por inmunoterapia parece bastante conveniente.

INTRODUCCIÓN
Los ácaros pertenecientes a la familia Pyroglyphidae (principalmente Dermatophagoides pteronyssinus, D. farinae y Euroglyphus mainei) se encuentran frecuentemente en el polvo doméstico y son una causa principal de enfermedades alérgicas. Se han identificado más de 10 alergenos en estos ácaros, siendo los más importantes (prevalencia > 80%) el grupo 1 (Der p 1, Der f 1, Eur m 1), de 25 kDa, y el grupo 2 (Der p 2, Der f 2, Eur m 2), de 14 kDa (1). Tanto las proteínas del grupo 1 como las del grupo 2 presentan % de identidad en su secuencia de aminoácidos superiores al 80%, lo que explica la alta reactividad cruzada encontrada entre estas especies de ácaros.
Además se han detectado otros ácaros pertenecientes a las familias Acaridae (Tyrophagus putrescentiae, Acarus siro) y Glycyphagidae (Glycyphagus domesticus, Lepidoglyphus destructor, Blomia tropicalis) que también pueden causar alergia.
B. tropicalis aparece en el polvo doméstico de zonas con clima tropical y subtropical, y es una causa independiente de sensibilización con respecto a D. pteronyssinus (2). Sin embargo, parece que existe cierta reactividad cruzada entre estos ácaros, que podría explicarse por la presencia de ciertos alergenos comunes, como por ejemplo el grupo 5 (3).
Los ácaros T. putrescentiae, A. siro, G. domesticus y L. destructor se han implicado principalmente en casos de alergia ocupacional en agricultores y ganaderos (4), aunque también aparecen en el polvo doméstico. Todos estos ácaros poseen grupo 2 como alergeno mayoritario (1) que podría estar involucrado en reacciones de reactividad cruzada. Sin embargo, los estudios de reactividad cruzada entre Dermatophagoides y "ácaros de almacén" han dado resultados contradictorios. Entre las razones plausibles para estas discrepancias tenemos la utilización de sueros de pacientes de diferentes orígenes, sin un conocimiento sobre la sensibilización clínica así como de la exposición a los diferentes ácaros. Por otro lado se han utilizado frecuentemente extractos de ácaros no estandarizados.
El objetivo del presente trabajo fue en primer lugar determinar el nivel de exposición a diferentes especies de ácaros en pacientes con historia clínica de alergia a ácaros en la provincia de Huelva, zona que posee condiciones climáticas muy adecuadas para el crecimiento de ácaros, lo que se demuestra en el alto nivel ambiental de alergenos de ácaros (Der p 1 y Der 2) en muestras de polvo (5). En segundo lugar, se ha realizado un estudio in vitro de reactividad cruzada entre las diferentes especies con relevancia clínica.

MATERIALES Y MÉTODOS
Pacientes
Se seleccionaron 133 pacientes de la provincia de Huelva (zona rural y urbana) diagnosticados de rinoconjuntivitis y/o asma por hipersensibilización a D. pteronyssinus. Se tomó una muestra de polvo del domicilio de los pacientes para la identificación de ácaros.

Muestras de polvo doméstico
Para la recogida de las muestras se utilizó la técnica del aspirado con un aspirador convencional, utilizando una bolsa nueva; en aquellos casos en los que el paciente no disponía de un aspirador se utilizó la técnica del cepillado.
Las muestras se recogieron del dormitorio del paciente y sala de estar principalmente, además del resto de la casa, incluidos baños y cocina. Los hogares no debían limpiarse al menos los 4 días previos a la recogida de la muestra. Las muestras se obtuvieron durante los meses de primavera y otoño, época en la que la reproducción de los ácaros es más rápida y siguiendo las recomendaciones de la bibliografía (6).
Se aspiró la superficie del colchón y los sofás durante aprox. 2 minutos, debajo y alrededor de la cama y cada esquina de las habitaciones (aprox. 2 min / m2). En el caso de existir alfombras, se aspiró cada m2 de ésta durante 2 minutos.
Las muestras de polvo se recogieron sobre etanol de 70º para su conservación y posteriormente se lavaron y filtraron repetidas veces y se realizó la identificación de ácaros por microscopia. Se identificaron todos los ácaros presentes en la muestra procesada o aprox. 100 ácaros individuales.

Pruebas cutáneas (PC) 
Se realizaron pruebas cutáneas (PC) en prick test (ALK-Lancet, Hørsholm, Dinamarca) por duplicado con extractos de D. pteronyssinus, D. farinae, G. domesticus, L. destructor y T. putrescentiae estandarizados biológicamente o en unidades de masa (ALK-Abelló, S.A. Madrid). Se utilizó histamina a 10 mg/ml como control positivo y solución salina como control negativo. El tamaño de la pápula se midió a los 15 minutos. Se consideraron como negativas las pápulas con diámetros inferiores a 3 mm.

Prueba de provocación conjuntival (PPC)
Esta prueba se realizó aplicando una gota de extracto de G. domesticus (ALK-Abelló, S.A.) a 10 BU/ml en el saco conjuntival. Si no se observaba reacción en 30 minutos se administraba una gota del extracto 100 BU/ml en el mismo ojo. El control negativo se llevó a cabo aplicando una gota de suero fisiológico en el saco conjuntival del otro ojo. Se consideró un resultado positivo cuando el paciente presentaba síntomas de hiperemia conjuntival, lagrimeo, prurito oculo-nasal, hidrorrea o estornudos en el lado donde se había administrado el extracto. 

Extractos de ácaros
La materia prima (cuerpos purificados de D. pteronyssinus, G. domesticus, T. putrescentiae y L. destructor) se extrajo al 10% (p/v) en PBS con Potter. Después de centrifugar, se dializó el sobrenadante contra PBS y se filtró por 0,22 µm. La determinación de proteínas se realizó por el método de Lowry. En el caso de D. pteronyssinus y L. destructor se cuantificaron los alergenos mayoritarios Der p 1, Der p 2 y Lep d 2 por ELISA basado en anticuerpos monoclonales. 

Valoración IgE específica
Se realizó por RAST. Se sensibilizaron discos de papel, previamente activados con BrCN, con los extractos de ácaros según describen Ceska et al. (7). Los discos se incubaron con 50 µL del suero de los pacientes y, posteriormente, con "100.000 cpm de 125I-anti-IgE mAb HE-2. Como Referencia se utilizaron discos sensibilizados con Lolium perenne y 4 diluciones de un "pool" de sueros de pacientes alérgicos a gramíneas que se había calibrado previamente con el sistema Pharmacia Phadebas( RAST. Como límite de detección se tomó el valor de 0,35 kU/L.
La determinación de la IgE específica a Lep d 2 se realizó de una manera similar, pero utilizando una técnica de ELISA, y presentando el Lep d 2 mediante un anticuerpo monoclonal específico (8).

RAST de inhibición 
Discos sensibilizados con extracto de ácaros se incubaron con 50 µL de suero del paciente y 50 µL de extracto inhibidor a diferentes concentraciones proteicas (rango 1000 -1 µg proteína/ml). Posteriormente, se lavaron los discos y se incubaron con "100.000 cpm de 125I-anti-IgE mAb HE-2. Finalmente, después de lavar los discos, se determinó su radiactividad.
El % de inhibición de la unión de IgE se calculó utilizando la fórmula:

100 x (1 - [(cpmx - cpm100%) / (cpm0% - cpm100%)])

Donde cpmx es la radiactividad media de discos con inhibidor a la concentración x, cpm0% es la de los discos en ausencia de inhibidor, y cpm100% la correspondiente al blanco.

RESULTADOS Y DISCUSIÓN
Se analizaron un total de 133 muestras de polvo doméstico. En ellas se identificaron los siguientes ácaros: Dermatophagoides en 126 muestras (94,7 %), G. domesticus en 72 muestras (54,1 %), T. putrescentiae en 54 muestras (40,6%), L. destructor en 22 muestras (16,5 %), A. sirus en 14 muestras (10,5 %) y Blomia en 9 muestras ( 6.7%).
De los 72 pacientes en los que se había detectado G. domesticus en su domicilio, se realizaron PC y PPC en 59 (81,9 %) con los siguientes resultados: 27 pacientes presentaron PC y PPC positivas a G. domesticus, 31 presentaron PC y PPC negativas y un paciente presentó una PC positiva, mientras que la PPC a G. domesticus fue negativa. En resumen, de los 59 pacientes estudiados in vivo, con exposición a G. domesticus, 27 (45,8 %, aprox. 25 % de la muestra original) presentaron sensibilización a este ácaro, y 32 (54,2 %) no mostraron sensibilización. No se observaron diferencias significativas con respecto al tipo de domicilio, rural o urbano.
La tabla I muestra los resultados de exposición (% ácaros) en las muestras de polvo de 22 de los 27 pacientes con sensibilización a G. domesticus.

El ácaro mas abundante fue D. pteronyssinus, presente en todas las muestras con una mediana del 42,8% del total de ácaros (rango 17,9% - 95,2%). G. domesticus fue también bastante abundante, mediana 30,7% (rango 1 - 78,3%). El siguiente ácaro en porcentaje fue T. putrescentiae, presente en el 50% de las muestras de polvo (mediana 15,8%) y por último L. destructor, presente en el 22,7% de las muestras (mediana 18,0%).
La tabla II muestra los resultados de la IgE específica sérica a los diferentes ácaros encontrados en el polvo doméstico de los 22 pacientes, así como al alergeno mayoritario grupo 2 de L. destructor, Lep d 2.
Todos los pacientes, excepto 1, presentaron IgE específica a D. pteronyssinus. Cuatro pacientes fueron negativos a G. domesticus. Curiosamente estos pacientes también fueron negativos a T. putrescentiae, L. destructor (uno de ellos débilmente positivo, 0,7 kU/l) y Lep d 2. Seis pacientes adicionales (total 10) fueron negativos a T. putrescentiae. Tres pacientes fueron monoespecíficos (a nivel de IgE) a D. pteronyssinus y un paciente fue negativo a este ácaro, con IgE positiva a G. domesticus, T. putrescentiae y L. destructor.
La detección de IgE a L. destructor y Lep d 2 en un 86% de los pacientes, a pesar de que sólo en el 22,7% de las muestras de polvo se detectó L. destructor, indica que debe existir reactividad cruzada con otros ácaros presentes en el ambiente.
La tabla III muestra los coeficientes de correlación entre los títulos de IgE de la tabla II. En el caso de la variable IgE a D. pteronyssinus no hubo correlación significativa con ninguna de las otras variables. Sin embargo, si se detectó una correlación altamente significativa (p<0.0001) entre la IgE a G. domesticus y L. destructor y la IgE a G. domesticus y Lep d 2, y muy significativa (p= 0,006) entre la IgE a G. domesticus y T. putrescentiae.
Estos resultados sugieren, por un lado, la ausencia de reactividad cruzada entre D. pteronyssinus y las otras especies de ácaros y, por otro lado, la presencia de reactividad cruzada entre G. domesticus, L. destructor y T. putrescentiae. Para confirmarlo, se realizó un experimento de RAST de inhibición con una selección de sueros de los pacientes. Los resultados se indican en la tabla IV. Se utilizaron varias concentraciones de inhibidor (rango 1000 - 1 µg/ml), y se indican en las tablas los % de inhibición máximos de unión de IgE en la zona de plateau.

Los extractos de G. domesticus, T. putrescentiae y L. destructor no fueron capaces de inhibir la unión de IgE a D. pteronyssinus (Tabla IVA) en ninguno de los 12 sueros individuales ensayados ( 100%, IC95: 0,78-1,00). Por otro lado, en el experimento reverso, D. pteronyssinus no fue capaz de inhibir la unión de IgE a G. domesticus, T. putrescentiae o L. destructor, indicando la ausencia de reactividad cruzada entre estos ácaros. Hay que tener en cuenta que en los experimentos de RAST de inhibición, porcentajes de inhibición inferiores al 15% no se consideran significativos.
La situación es diferente con los otros ácaros; L. destructor fue capaz de inhibir en un 84% (mediana de los 12 sueros ensayados) la unión de IgE a G. domesticus, lo que representa aprox. un 90% de la inhibición alcanzada por el propio extracto de G. domesticus. En el experimento reverso, realizado con 2 sueros de pacientes en los que se habían detectado niveles ambientales altos de L. destructor, se obtuvieron valores de inhibición comparables, lo que indica la existencia de una importante reactividad cruzada entre G. domesticus y L. destructor, y que ambos ácaros podrían actuar como sensibilizantes primarios.
El caso de T. putrescentiae es intermedio. Este ácaro fue capaz de inhibir parcialmente la unión de IgE a G. domesticus (30%, valor mediana de 7 sueros ensayados) y la unión de IgE a L. destructor (41% en un suero ensayado). Sin embargo, en el experimento reverso, las inhibiciones alcanzadas por G. domesticus y L. destructor fueron del 81,5 y 70% respectivamente (90 y 77 % de la inhibición producida por el propio Tyrophagus). Este resultado indica la existencia de una reactividad cruzada parcial entre estos ácaros, y que el extracto de T. putrescentiae es "incompleto" desde el punto de vista alergénico con respecto a G. domésticus y L. destructor, es decir, T. putrescentiae no está actuando como sensibilizante primario en los pacientes estudiados, a pesar de que está presente en el ambiente de estos pacientes.
¿Cuál sería a nivel molecular el alergeno(s) responsable(s) de esta reactividad cruzada?. Existen datos bastante sugerente de que el grupo 2 de estos ácaros (es decir Gly d 2, Lep d 2 y Tyr p 2) debe estar implicado. En primer lugar, las secuencias de aminoácidos de Gly d 2 y Lep d 2 presentan un % de identidad de alrededor del 80%, mientras que el % de identidad de Gly d 2, Lep d 2, Tyr p 2 respecto a Der p 2 es de alrededor del 40%. El % de identidad de Tyr p 2 y Gly d 2/Lep d 2 es intermedio (9, 10). En segundo lugar, todos los pacientes con IgE específica a G. domesticus tienen también IgE a Lep d 2 (Tabla II), existiendo una correlación altamente significativa (Tabla III). Finalmente, resultados de IgE-inmunodetección a G. domesticus, utilizando suero de pacientes individuales, indican la presencia fundamentalmente de una banda fijadora de IgE de p.m. "14 kDa que coincide con el descrito para el grupo 2 de ácaros (datos no mostrados). Además la preincubación del suero del paciente con extracto de L. destructor produce una inhibición de la unión de IgE a la banda de 14 kDa (supuestamente Gly d 2) en 5 de 6 sueros ensayados.

CONCLUSIONES
1.- El ácaro G. domesticus se encuentra, en la zona de Huelva, en el polvo doméstico del 50% de pacientes con síntomas de alergia a ácaros, produciendo sensibilización en aproximadamente el 50% de los casos (25% del total). Esta sensibilización es independiente de la producida por D. pteronyssinus, que es el ácaro predominante en el área.
2.- Existe una importante reactividad cruzada entre G. domesticus y L. destructor. No obstante, teniendo en cuenta el bajo nivel ambiental de este último ácaro, no parece que sea un sensibilizante primario importante en la zona de Huelva, aunque es posible que si lo sea en otras áreas. 
3.- Se ha detectado una reactividad cruzada limitada entre G. domesticus y T. putrescentiae y, a pesar de que este ácaro se ha detectado en el 40% de las muestras ambientales, no parece ser sensibilizante primario en el área.
4.- Los alergenos grupo 2, es decir, Gly d 2, Lep d 2 y Tyr p 2 parecen estar involucrados en esta reactividad cruzada. Tyr p 2 podría comportarse como una forma hipoalergénica natural.
A la vista de estos resultados, la incorporación de G. domesticus en la batería diagnóstica primero y en el tratamiento por inmunoterapia después, en aquellos casos indicados, parece ser bastante conveniente.

BIBLIOGRAFIA
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