Angioedema hereditario, nuevas claves para su comprensión y tratamiento

MODERADOR:
Dra. Concepción López Serrano.
Hospital Universitario La Paz. Madrid.

Alteraciones genéticas en el Angioedema Hereditario
Olga Roche, Alvaro Blanch, Margarita López Trascasa.
Hospital Universitario La Paz. Madrid.

Abstract:
El gen del C1-inh está formado por 8 exones que se extienden a lo largo de 17 Kb. Mutaciones en este gen producen el Angioedema Hereditario (HAE).

En una serie de 88 familias españolas afectas de HAE se ha realizado el estudio molecular para caracterizar las mutaciones que presentan en el gen C1-inh.El exón 8 se ha estudiado mediante PCR y posterior secuenciación, los exones 1 al 7 mediante SSCP (polimorfismo de conformación de la cadena sencilla), y las grandes deleciones e inserciones mediante Southern blot. En las familias en las que no se ha identificado la mutación siguiendo esta estrategia se han secuenciado todos los exones.

De esta forma se ha caracterizado la mutación en el 97% de las familias. Las alteraciones encontradas son muy heterogéneas y se distribuyen prácticamente a lo largo de todo el gen. En 26 familias (30%) se ha encontrado la mutación responsable de la enfermedad en el exón 8. Este exón codifica el centro activo, y se ha descrito que aunque las mutaciones se encuentran a lo largo de todo el gen, hay un acumulación moderada en este exón. A diferencia de otras series se ha encontrado un alto porcentaje de mutaciones en el exón 3 (25%). Diez de las familias presentan grandes deleciones o inserciones.

Resumen:
El Angioedema hereditario (HAE) es una enfermedad que se produce por la deficiencia del inhibidor de C1 (C1-inh) del sistema de complemento. Analíticamente se distinguen 2 fenotipos, el tipo I que lo presentan el 85% de los casos, los cuales presentan niveles antigénicos disminuidos de C1-inh y el tipo II, que lo presenta el 15% restante, en los que los niveles de C1-inh son normales o están ligeramente aumentados pero hay una proteína no funcional. El patrón de herencia de la enfermedad es autosómico dominante.

El C1-inh es una glicoproteína plasmática de peso molecular 105 Kda que pertenece a la superfamilia de los inhibidores de serín proteasas o Serpinas. Se caracteriza porque no tiene actividad enzimática, y además de actuar sobre la proteína C1 del sistema de complemento, actúa sobre otras proteasas de los sistemas de coagulación, fibrinolisis y quininas.

El gen que codifica para el C1-inh se encuentra localizado en el cromosoma 11 (cr11q11.2q13) y se extiende a lo largo de 17 Kb. Está dividido en 8 exones separados por 7 intrones, siendo el exón 8 el que codifica el centro activo de la proteína. La transcripción del gen genera un ARN mensajero de 1827 pb. 
El gen se caracteriza por el alto número de secuencias repetidas de la familia Alu que presenta. Estas secuencias son las secuencias cortas y repetidas que se encuentran intercaladas en mayor número en el genoma humano, habiendo por término medio una cada 5-10 Kb. En el C1-inh encontramos 17, la mayoría de ellas agrupadas en tándem alrededor del exón 4. 

Hasta ahora se han descrito más de 100 mutaciones diferentes, de las que aproximadamente el 20% son grandes deleciones e inserciones, y el 80% restante son mutaciones pequeñas o puntuales. Las grandes deleciones e inserciones parecen estar relacionadas con la acumulación de repeticiones Alu, que al presentar hasta un 80% de homología favorecen los procesos de recombinación homóloga y confieren cierta inestabilidad genética al gen.

Las mutaciones puntuales encontradas son muy heterogéneas y se pueden encontrar a lo largo de todo el gen, aunque hay un mayor porcentaje en el exón 8. Podemos encontrar cambios de aminoácido (100% de los casos HAE tipo II y 36% de los casos de HAE tipo I), desplazamientos del marco de lectura (14%), apariciones de un codon stop prematuro (10%), alteraciones del proceso de splicing del ARN mensajero (7-10%), mutaciones en la zona promotora (4%), y pequeñas deleciones (3%).
El HAE tipo II se produce por mutaciones que provocan el cambio de un aminoácido en el centro activo de la proteína, Arg444, o en regiones próximas, y que van a tener como consecuencia la secreción de un C1-inh no funcional. Las mutaciones que dan lugar al HAE tipo I son más heterogéneas, y en general van a producir proteínas en las que se altera su procesamiento y transporte intracelular.

En nuestro laboratorio se han recogido datos clínicos y material genético de 112 familias afectas de HAE provenientes de las distintas comunidades autónomas españolas. De estas familias, 100 son un tipo I y 12 son tipo II. 

Una característica de esta enfermedad es el alto número de casos esporádicos sin historia familiar previa de HAE y que puede llegar al 30% de los casos registrados. Este hecho se puede explicar por la inestabilidad genética del gen, que está producida por el alto número de secuencias Alu y por la presencia de dinucleótidos metilados CpG, que se caracterizan por ser puntos calientes de mutación porque la citosina en este dinucleótido está metilada y puede sufrir un proceso espontáneo de deaminación. De los casos recogidos, en nuestra serie 17 pacientes no presentan historia familiar previa de HAE por lo que puede tratarse de mutaciones de novo.

Una serie de 88 familias ha sido estudiada a nivel molecular. Se ha analizado el exón 8 amplificándolo mediante PCR y posterior secuenciación. En 26 de las familias se ha encontrado la mutación en este exón (30%) con 17 mutaciones distintas. Siete de estas familias no presentan historia familiar previa, y en cinco de ellos se ha estudiado a los padres demostrando que se trata de mutaciones de novo.

El resto de los exones se han analizado mediante SSCP (polimorfismo de conformación de la cadena sencilla). Esta es una técnica electroforética que permite distinguir la diferente migración de 2 cadenas de ADN que se diferencien en una sola base, porque las hebras van a adoptar conformaciones distintas. Comparando la migración de muestras de controles y pacientes se determina en qué exón del gen se encuentra la mutación y se pasa a secuenciar ese exón concreto.

En 20 de las familias no se ha encontrado ninguna alteración en el exón 8 ni en la SSCP, por lo que se estudian mediante Southern blot. Esta es una técnica que permite detectar grandes deleciones e inserciones en el gen. Para hacer el southern blot, primero se digiere el ADN genómico con la enzima de restricción Bcl I que genera un fragmento de 21 Kb que contiene todo el gen C1-inh, y tras electroforesis en gel de agarosa y posterior transferencia a una membrana de nylon se detectan los fragmentos mediante un revelado quimioluminiscente. Como sonda se utiliza el DNA complementario completo marcado con digoxigenina, que se detecta con un anticuerpo conjugado con fosfatasa alcalina que cataliza una reacción quimioluminiscente. De esta forma se han encontrado en 10 familias polimorfismos de longitud del fragmento de restricción, que varían en tamaño entre 2 Kb por encima y 4 Kb por debajo del tamaño del fragmento normal.

En 10 familias no se ha visto ninguna alteración por ninguna de estas técnicas, por lo que se está procediendo a secuenciar todos los exones para buscar las mutaciones puntuales que no se han detectado por SSCP, cuya sensibilidad no es nunca del 100%.

La distribución por exones de las mutaciones encontradas en esta serie es muy parecida a los datos publicados, excepto por el alto número de mutaciones que han aparecido en el exón 3 que casi alcanza el porcentaje de mutaciones en el exón 8.

Las mutaciones puntuales más frecuentes son las que producen cambio de aminoácido, seguidas por las pequeñas deleciones e inserciones y las que producen la aparición de un codon stop, las mutaciones que afectan a la secuencia consenso de splicing, y por tanto al procesamiento del ARNm, y las que se encuentran en zonas exónicas pero en el límite con el intrón y pueden producir un cambio de aminoácido o afectar al proceso de splicing.

Gracias a este estudio se ha revisado y descartado el diagnóstico de HAE en cinco casos y se ha aclarado la ausencia de historia familiar en otros dos casos. Además gracias a los datos recogidos se está realizando un censo de la población española afecta de angioedema hereditario.

Bibliografía: 
Stoppa-Lyonnet D. Carter PE. Meo T. Tosi M. Clusters of intragenic Alu repeats predispose the human C1 inhibitor locus to deleterious rearrangements (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87: 1551-1555.

Tosi M. Structural and functional aspect of C1-Inhibitor at the gene and protein level (1998) Immunobiol. 199:358-365.

Blanch A. Roche O. López-Granados E. Fontán G. López-Trascasa M. Detection of C1 Inhibitor (SERPING1/C1NH) mutations in Exon 8 in patients with hereditary angioedema: Evidence for 10 novel mutations (2002) Human Mutation. Mutation in Brief 544.

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