Estandarizaciones de alergenos en España

MODERADOR:
Dr. José M. Olaguibel.
Hospital Virgen del Camino. Pamplona.

TÉCNICAS DE ESTANDARIZACIÓN I.
Alergenos mayoritarios y minoritarios
Dr. Domingo Barber, Dr. Florentino Polo, Dr. Manuel Lombardero
Departamento de Investigación y Desarrollo. Laboratorio ALK-Abelló, S. A. Madrid.

INTRODUCCIÓN
La inmunoterapia específica con extractos alergénicos se viene realizando desde hace prácticamente 100 años¹.
Durante la mayor parte de este período de tiempo se desconocía totalmente la naturaleza de las sustancias involucradas en la reacción alérgica y los mecanismos subyacentes. No es, pues, extraño que la forma de asignar potencia a los extractos se realizara en base al porcentaje de extracción del material de partida (unidades Noon).
En 1966, el descubrimiento de la molécula de IgE², lleva asociado un avance cualitativo en las metodologías diagnósticas y un interés creciente en el establecimiento de métodos de estandarización en base  a las mismas³.

1.-ESTANDARIZACIÓN BIOLÓGICA DE EXTRACTOS ALERGÉNICOS
Los extractos alergénicos son soluciones acuosas de materiales alergénicos como polen, epitelio de animales, ácaros, venenos de insectos u hongos. Hasta el momento, no hay ninguna característica estructural que permita prever la alergenicidad de una molécula. La definición de un alergeno se realiza en base al criterio funcional de ser capaz de provocar una respuesta IgE en individuos susceptibles. La práctica totalidad de los alergenos son proteínas y, al menos en los alergenos por inhalación, fácilmente solubles en agua.
Los alergenos se asocian a partículas micrométricas y son transportados en el aire, depositándose en las vías respiratorias bajas y estimulando la respuesta inmune del paciente. Según esta definición, cualquier sustancia antigénica tiene el potencial de convertirse en alergénica.

1.1.    EXTRACTOS DE REFERENCIA
El primer paso en el proceso de estandarización consiste en la preparación de un extracto de referencia. Esta preparación debe contener los alergenos relevantes de un material alergénico determinado, debe ser representativa de posteriores lotes fabricados y debe ser estable. Posteriormente se utilizará para comparar y juzgar la calidad de lotes de fabricación y conseguir la consistencia del producto lote a lote, tanto en términos de actividad biológica  como de composición alergénica.

1.2.    VALORACIÓN DE LA ACTIVIDAD ALERGÉNICA DE UN EXTRACTO REFERENCIA
Denominamos actividad biológica de un extracto a su facultad de inducir una respuesta en la piel de los pacientes alérgicos a las sustancias alergénicas contenidas en el mismo.
Dado que la respuesta biológica varía ampliamente de un paciente a otro, debe trabajarse con un número de pacientes representativo de la población de pacientes alérgicos.
Puesto que existe una correlación entre la concentración de sustancias alergénicas y el tamaño de pápula inducido, podemos trazar curvas dosis-respuesta de los pacientes estudiados.
En general, a la concentración del extracto que induce una determinada área de pápula media se le asigna un valor de n unidades de actividad biológica, bien de modo absoluto (BU) o referidas al área inducida por una sustancia control como histamina (HEP) (Fig. 1).

1.3.    POTENCIA DE LOTES POR RAST-INHIBICIÓN
El extracto referencia se utiliza en un ensayo de laboratorio, aplicando como reactivo un conjunto de sueros de pacientes alérgicos para asignar la actividad de los sucesivos lotes fabricados (Fig. 2).
La estandarización biológica y el control de los lotes fabricados son hoy en día un requisito legal para obtener el registro de productos de inmunoterapia en la Unión Europea (Fig. 3)

2.    ALERGENOS MAYORES Y MENORES
De las distintas moléculas alergénicas contenidas en un extracto, no todas son reconocidas por los pacientes alérgicos con la misma frecuencia.
En general, un paciente alérgico reacciona prioritariamente frente a determinados antígenos, bien porque son más abundantes o porque presentan mayor capacidad sensibilizante.
Se denominan alergenos mayoritarios aquellos frente a los cuales presentan IgE específica más del 50% de los enfermos alérgicos.
Del mismo modo, los alergenos minoritarios son reconocidos por menos del 50% de los pacientes alérgicos.

2.1.    ESTANDARIZACIÓN UM
Normalmente un extracto alergénico contiene uno o dos alergenos mayoritarios.
No cabe duda que el control de la cantidad de los alergenos mayoritarios de un extracto supondrá un avance en la calidad del mismo. Esta estandarización permite determinar con precisión la cantidad de alergeno mayoritario contenida en el extracto. Es lo que entendemos por estandarización en unidades de masa (estandarización UM).
La estandarización en Unidades de Masa permite dosificar de forma precisa la cantidad del ingrediente activo relevante.
Normalmente hay una relación directa entre actividad biológica y contenido de alergeno mayoritario, pero en casos donde hay más de un alergeno mayoritario, esta relación no es tan clara y puede  hber extractos con concentraciones diferentes de alergenos mayoritarios sin afectar aparentemente a la actividad biológica total.
El caso más llamativo es el de los ácaros del género Dermatophagoides, donde el contenido relativo de los alergenos mayores (Fig. 4) a los que los pacientes estaban expuestos difería del utilizado en la práctica clínica para diagnosticar o tratar a los mismos.
Así, mientras que la ratio natural de exposición Der 1/Der 2 era 2, el rango encontrado en diversos extractos comerciales oscilaba de 0,05 a 58 (Fig. 5)
La estandarización UM, desarrollada por primera vez por el Grupo ALK-Abelló en 1989, permitió ajustar el sistema productivo para garantizar la reproducibilidad lote a lote y la coincidencia con la ratio natural de exposición4.
La relevancia clínica de la estandarización UM puede ejemplificarse en las diferentes prestaciones diagnósticas de extractos de D. pteronyssinus con igual contenido de grupo 1 pero diferente contenido de grupo 2 (Fig. 6).
Un 20% de los pacientes alérgicos a ácaros no eran diagnosticados con un extracto de bajo contenido en grupo 2, que era el habitualmente utilizado antes de la estandarización UM del extracto.
El extracto B era incapaz de diagnosticar a un 20% de pacientes alérgicos que sí eran diagnosticados con el A.
La explicación surge del análisis de la respuesta individual a los alergenos mayores de los pacientes individuales (Fig. 7). Un número significativo de pacientes presentaban elevados niveles de IgE específica a grupo 2 y niveles mucho más bajos a grupo 1.
Estos pacientes no eran diagnosticados (y tratados) de modo correcto con extractos de bajo contenido en grupo 2. Los alergenos de grupo 1 se secretan en partículas fecales y se acumulan en el cultivo de ácaros, presentando unos niveles relativos a grupo 2 mucho más elevados a los observados en el medio natural. La solución a este problema implica purificar la fracción de ácaros puros del cultivo.

2.2.    EL PAPEL DE LOS ALERGENOS MENORES
La diferenciación entre alergenos mayores y menores está basada en criterios estadísticos. En general, no considera el porcentaje de IgE específica a un extracto que está dirigido a cada molécula alergénica. Cada paciente puede presentar una reactividad única, es decir, para un paciente concreto el criterio relevante es saber qué alergenos del extracto reconoce y el nivel de IgE específica a los mismos.
El reconocimiento de un alergeno menor estará determinado por su capacidad de sensibilizar a pacientes atópicos y con su concentración ambiental.
Cuando los niveles de exposición en distintas áreas geográficas varían significativamente, es esperable que las prevalencias de los distintos alergenos de una fuente alergénica sean a su vez diferentes.

2.2.1ALERGENOS DE OLIVO
2.2.1.1. El extracto:
El extracto de olivo contiene al menos 9 alergenos numerados del Ole e 1 al Ole e 95. El único alergeno mayoritario es el Ole e 1, que sensibiliza a la práctica totalidad de los pacientes alérgicos a olivo. El resto de alergenos incluye panalergenos, como profilinas, polcalcinas y moléculas alergénicas únicamente identificadas en olivo hasta la fecha. Uno de los alergenos más relevantes es el Ole e 9, glucanasa con posible reactividad cruzada con otros pólenes y alimentos.
La estandarización biológica del olivo permitió observar una acusada variabilidad en la actividad de distintas materias primas de polen (Fig. 8)⁶.
La identificación del alergeno mayoritario y el desarrollo de metodologías analíticas⁷ permitió asignar esta variabilidad en la actividad a distintas concentraciones del alergeno mayoritario (Ole e 1).
En los mismos lotes anteriormente estudiados,  el contenido de Ole e 1 variaba hasta 30 veces de unos lotes a otros. Fijando una relación entre actividad biológica y contenido de Ole e 1, 4 lotes (33%) anteriormente aceptables eran ahora rechazados.
Vemos que el resultado de la estandarización UM del extracto es la reducción de la variabilidad, seleccionando los lotes que cumplen criterios de calidad más estrictos con una clara significación clínica (eficacia/seguridad).
A pesar de estos avances en el control del extracto, eventualmente se producían brotes episódicos de reacciones adversas, usualmente asociados a áreas geográficas concretas (Jaén y Córdoba) y no explicables con los métodos analíticos disponibles (Figura 9). Este hecho nos lleva a plantearnos si variaciones del contenido de alergenos menores podrían ser responsables de las mismas.
El Ole e 98, había sido identificado como un alergeno minoritario relevante en áreas de Andalucía y nos propusimos, en colaboración con el grupo dirigido por la Dra. Rosalía Rodríguez , desarrollar métodos basados en anticuerpos monoclonales específicos para cuantificar el mismo y estudiar su variabilidad.
Los resultados, que se muestran en la Figura 10, manifiestan una variabilidad extrema en los niveles de Ole e 9. Se observan diferencias en el contenido relativo de hasta 1000 veces. Incluso en pólenes con similar actividad biológica y concentración de Ole e 1, los niveles de Ole e 9 varían hasta 300 veces.
Vemos de nuevo, claramente, que la aplicación de criterios de calidad más estrictos supone un aumento claro en la calidad del extracto alergénico.

2.2.1.2. El paciente:
Como ya hemos señalado, el concepto de alergeno mayor o menor está basado en datos estadísticos (prevalencias) mientras que la relevancia clínica está ligada a pacientes concretos. Un alergeno menor puede ser muy relevante desde el punto de vista clínico para los pacientes sensibilizados.
En un proyecto de investigación, RED FIS G03/94, en el que participa nuestra Empresa, hemos estudiado los perfiles moleculares de distintos alergenos en pacientes sensibilizados a pólenes de diversas localizaciones geográficas.
Los resultados de la sensibilización a Ole e 1 y Ole e 9 de pacientes de Madrid y Jaén se muestran en la Fig. 11. Observamos que la prevalencia de sensibilización a Ole e 9 en pacientes alérgicos a olivo pasa de un 5% en Madrid a un 50% en Jaén. Un alergeno minoritario en el contexto global de la alergia a olivo se comporta como mayoritario en un área geográfica concreta.
Pero tal vez el dato más interesante es que las medianas de IgE específica a Ole e 9 en pacientes sensibilizados son muy elevadas, tanto en Madrid como en Jaén, lo que parece apoyar una gran relevancia clínica.
Está claro que los datos de variabilidad del polen en contenido de Ole e 9 junto con los datos clínicos descritos pueden explicar los brotes episódicos de reacciones adversas a olivo y hacen necesario un mayor control de la variabilidad alergénica del polen.
Los niveles extremos de polen de olivo a los que los pacientes andaluces se hallan expuestos implican que el perfil clínico de los mismos sea diferente.
Es interesante señalar que no se han encontrado pacientes sensibilizados a Ole e 9 sin sensibilización simultánea a Ole e 1, lo que sugiere que Ole e 9 puede ser un marcador de severidad en la sensibilización a olivo.
Quedan todavía muchos puntos por esclarecer en la alergia a olivo pero no cabe duda que la capacidad de disponer de diagnósticos moleculares avanzados facilitará esta tarea.

3.    EL FUTURO: ALERGENOS RECOMBINANTES
Hasta la fecha, la calidad de los extractos se ha conseguido controlando de modo cada vez más eficiente la variabilidad natural. El producto en sí mismo sigue siendo idéntico a los extractos utilizados en los últimos 100 años.
La acumulación de parámetros analizados hace que solamente se consideren válidos el 20% de los lotes anteriormente aceptados con una implicación evidente en la calidad de los diagnósticos y tratamientos pero con una complejidad extrema para seleccionar materiales alergénicos adecuados (Fig. 12).
El siguiente paso en la evolución de los diagnósticos y tratamientos de alergia será el empleo de alergenos puros (naturales o recombinantes).
Si bien su empleo diagnóstico es ya una realidad y su uso se generalizará en los próximos años, el empleo de alergenos recombinantes en inmunoterapia precisará probablemente del establecimiento de un marco legal adecuado, actualmente inexistente, que posibilite su uso (Fig. 13).

BIBLIOGRAFÍA:
1. Noon, L. Prophylactic inoculation against hay fever. Lancet 1911;1:1572-1573.
2. Ishizaka k, Ishizaka T, Hornbrook MM. Physicochemical properties of reaginic antibody. V. Correlation of reaginic activity with gamma-E-globulin antibody. J Immunol 1966;97:840-853.
3. Løwenstein H. Report on behalf of the International Union of Immunological Societies (I.U.I.S.) Allergen Standardization Subcommittee. Arb Paul Ehrlich Inst. 1983;78:41-48.
4. Carreira J, Lombardero M. Ventas P. New developments in in vitro methods. Quantification of clinically relevant allergens in Mass Units. Arb Paul Ehrlich Institut. 1994;87:155-156.
5. Rodríguez R, Villalba M. Batanero E, González EM, Monsalve RI et al. Allergenic diversity of the olive pollen. Allergy. 2002;57(71):6-16.
6. Barber D, Carpizo JA, García-Rumbao MC, Polo F, Juan F. Allergenic variability in Olea pollen. Ann Allergy. 1990;64(1):43-46.
7. Lombardero M, Quirce S, Duffort O, Barber D, Carpizo J, Chamorro MJ, Lezaun A, Carreira J. Monoclonal antibodies against Olea europaea major allergen: allergenic activity of affinity-purified allergen and depleted extract and development of a radioinmmunoassay for the quantitation of the allergen. J Allergy Clin Immunol. 1992;89(4):884-894.
8. Huecas S, Villalba M, Rodríguez R. Ole e 9, a major olive pollen allergen is a 1,4-beta-glucanase. Isolation, characterization, amino acid sequence, and tissue specifity. J Biol Chem. 2001;2796(30):27959-66.