Estandarizaciones de alergenos en España

MODERADOR:
Dr. José M. Olaguibel.
Hospital Virgen del Camino. Pamplona.

TÉCNICAS DE ESTANDARIZACIÓN II.
Dr. Enrique Fernández-Caldas, Dr. Jerónimo Carnés, Dr. Víctor Iraola, Dra. Mayte Gallego
Departamento de Investigación y Desarrollo. Laboratorios LETI, S.L. Madrid.

Introducción
Los extractos alergénicos se han convertido en una parte fundamental del diagnóstico y tratamiento de las enfermedades alérgicas. Por ello, las autoridades sanitarias consideran su regulación como la de los otros medicamentos. Según el Real Decreto 288/91 y por transposición de la Directiva Comunitaria 89/342, modificada posteriormente por la Directiva 2001/83, los extractos alergénicos son productos destinados a identificar o provocar una modificación adquirida y específica de la respuesta inmunológica a un agente alergenizante1. Igualmente, el mismo Real Decreto establece como productos inmunológicos los sueros, las vacunas, las toxinas y alergenos, incluidas las vacunas individualizadas, considerando especialidades farmacéuticas a los fabricados industrialmente. Las Normas de Correcta Fabricación (Good Manufacturing Practice, o GMP) y el control de calidad de los extractos de alergenos y vacunas individualizadas están también incluidas en la regulación, lo que facilita el cumplimiento de las mismas y el control de los medicamentos en su adaptación a los alergenos. En su apartado de Documentación química básica, y concretamente en la actividad alergénica (3.2.2.) se definen los principios en los que se basa la estandarización de los alergenos y el establecimiento de muestras de referencia interna, destinadas a la estandarización de la producción. La Farmacopea Europea define a los extractos alergénicos como preparados farmacéuticos derivados de extractos de materias originales que existen en la naturaleza y que contienen alergenos, es decir,  sustancias que causan y/o provocan una enfermedad alérgica. Dentro de esta definición se excluyen los alergenos recombinantes2.
Dentro de una clasificación general, se distinguen dos tipos diferentes de extractos: a) extractos estandarizados biológicamente en función de la potencia biológica de los mismos, donde los sucesivos lotes son valorados comparativamente con el alergeno de referencia mediante técnicas in vitro y b) alergenos no estandarizados biológicamente. En este último caso la uniformidad de la producción debe ser mantenida en base únicamente, a una estandarización de la producción (cantidad inicial del material extraído) o a una valoración química del contenido proteico. De acuerdo con estos ensayos, el patrón de referencia es quien indica la aceptabilidad o no de los siguientes lotes de producto. Estos deben poseer unas características similares al patrón de referencia. En caso de no cumplir estas especificaciones, y no tener un perfil antigénico similar, el producto es rechazado por el departamento de Control de Calidad. En la Figura 1 observamos varios patrones de extractos de Betula verrucosa (variedad alba). En este caso, el extracto de la fila 8 se hubiera rechazado para su uso. En la Figura 2 se observa como se comparan dos extractos de Dermatophagoides pteronyssinus con un estándar usando densitometría de scanner. En el caso a, el extracto sería también rechazado

Procesos de fabricación de extractos
Es conocido que en la naturaleza existen diversas fuentes de alergenos (ácaros, pólenes, hongos, epitelios, alimentos, Anisakis spp., fármacos, látex, etc.) responsables de los procesos de sensibilización en pacientes susceptibles de desarrollar los cuadros alérgicos. Muchos de estos alergenos están bien caracterizados y secuenciados, pero la mayoría, aún están sin identificar y sin analizar en profundidad. Una característica importante de los alergenos es que son capaces de producir una respuesta alérgica, aun encontrándose en concentraciones muy pequeñas.
Los alergenos no son sustancias intrínsecamente tóxicas y generalmente son inocuas en ausencia de una reacción alérgica. No todos los alergenos son reconocidos con la misma frecuencia, ni intensidad por todos los individuos sensibilizados. Para distinguir estas diferencias se introdujeron los términos de alergenos mayores y menores. Esta clasificación está basada en la presencia de IgE o de positividad de pruebas cutáneas en pacientes sensibilizados frente a un extracto. Un alergeno mayor se define como un alergeno que es reconocido por más del 50% de una población de pacientes sensibles al extracto al cual pertenece el alergeno. Esta clasificación es orientativa ya que pueden existir varios alergenos mayores en el mismo extracto3, o incluso alergenos menores que pudieran tener una gran importancia en ciertos pacientes. Se estima que el número de alergenos mayores presentes en un extracto alergénico puede oscilar entre 1 y 7.
A pesar de que el conocimiento sobre las características de los alergenos ha avanzado en los últimos años, aun no se ha esclarecido el por qué determinadas moléculas o proteínas son capaces de unir IgE. Se desconocen sus características intrínsecas como pueden ser su función biológica, su estructura interna o su naturaleza bioquímica que conducen a la estimulación de los linfocitos Th2 en lugar de mediar una respuesta inmunitaria ordinaria. La identificación de estas características comunes podrían esclarecer los procesos de sensibilización. Recientemente, Furmonaviciene y Shakib4 han sugerido que la homología de determinadas secuencias de aminoácidos en los alergenos, como resultado de una evolución convergente y una estructura tridimensional similar, puede ser una característica común de los alergenos5.
Hasta el momento se han establecido ciertas características comunes entre estas moléculas. La resistencia a la proteolisis, especialmente en alergenos alimentarios, parece ser una característica común a casi todos ellos. La presencia de glúcidos unidos a la proteína parece que contribuye también de manera importante a la alergenicidad, demostrándose  incluso respuesta alérgica frente a residuos glucídicos. Por último, la actividad biológica de las proteínas, especialmente su actividad enzimática proteolítica, es considerada como una de las responsables de una respuesta inmune tipo 2, especialmente en ácaros y hongos.
El proceso de fabricación y estandarización de extractos alergénicos abarca toda una serie de etapas, incluyendo la selección de la materia prima más adecuada, la fabricación de los extractos siguiendo la normativa GMP, la determinación de la potencia total de los extractos, el desarrollo de inmunoensayos para cuantificación de alergenos mayoritarios y minoritarios, la caracterización de los alergenos, y el desarrollo de estudios clínicos de eficacia a doble ciego controlados con placebo que avalen su eficacia. Este proceso está dirigido, en muchos casos, al registro de los productos para diagnóstico y tratamiento y también para el estudio de los mecanismos implicados en la alergia.
La selección de la materia prima es una parte fundamental a la hora de fabricar los extractos6,7. En recientes estudios se ha comprobado que no todas las materias primas son idóneas para la fabricación de extractos alergénicos. Por ejemplo, en el caso de manzanas se han detectado diferencias importantes en el perfil antigénico de las mismas, según se trate de una variedad u otra8 (Figura 3). Además el contenido proteico de la piel en frutos de Rosaceas es superior al de la pulpa con lo cual se recomienda el uso diagnóstico de los extractos de piel9. Lo mismo ocurre con pólenes de diferentes variedades de olivo, ya que algunas variedades son más ricas en determinados alergenos que otras10. En general, parece ser que las características ambientales, especialmente la lluvia y la temperatura en los meses anteriores a la floración tienen una importancia crítica en la producción de alergeno por parte de los pólenes11.
En el caso de los hongos, la selección de la materia prima de partida (esporas o fracción metabólica) y de la cepa adecuada, complica aun más el proceso de estandarización12. En este sentido hemos realizado la medición del alergeno Alt a 1 en varias cepas de Alternaria alternata obteniéndose resultados dispares (Figura 4). La ausencia de estudios a doble ciego controlados con placebo usando extractos de A. alternata, dificulta la selección de las cepas, por lo que no se puede recomendar el uso de una cepa determinada.
Otro factor importante a tener en cuenta es la calidad de los extractos. Es clave la ausencia de contaminantes orgánicos (otros pólenes o tejidos vegetales, esporas, etc.) o plaguicidas, la riqueza, la pureza y las características bioquímicas del producto (humedad, potencia o perfil antigénico). Para fabricar extractos de calidad es necesario controlar parámetros como la solución extractante13, cuya elección depende de las características de la materia prima con la que se va a trabajar, y el tamaño de poro de los procesos de diálisis para eliminar material irrelevante. El tamaño de poro se ha reducido hasta 3 ó 5 kDa, ya que han sido descritos alergenos con tamaños moleculares inferiores a 10 kDa.
En conclusión, estandarizar es un proceso clave que depende de muchos factores que deben estar controlados. Factores importantes son la selección de la materia prima, el líquido extractante, el tiempo de extracción, la diálisis y el proceso de liofilización. Si se pretende que los extractos de distintas compañías farmacéuticas sean intercambiables, se necesita que todas extraigan el mismo tipo (y variedad) de materia prima, con el mismo solvente y durante el mismo tiempo y que se dialice por el mismo tipo de membrana.

¿Cuál debe ser la composición alergénica de los extractos?
Los postulados de Thommen resumen las características que debe tener una sustancia para que sea considerada como alergénica14. Estas características son: que esté presente en el medioambiente, que esté en una cantidad necesaria para producir síntomas, que induzca la producción de IgE específica y que produzca síntomas tras su inhalación. La selección de la materia prima es un paso previo y esencial para la obtención de buenos extractos alergénicos, eficaces para diagnóstico y tratamiento y que sean representativos del medioambiente del paciente. En un extracto alergénico deben estar presentes todos los alergenos susceptibles de provocar una reacción alérgica y, en la medida de lo posible, lo ideal sería que se encontraran en una proporción similar a la que se encuentran en su forma nativa.

Extractos de ácaros
En estudios realizados en nuestro laboratorio, se observó que extractos individuales de cuerpos y de heces del ácaro D. pteronyssinus tenían perfiles de alergenos similares, detectándose la presencia de más bandas en los extractos somáticos. En muchos casos, estos extractos también tienen una potencia biológica mayor15. Sin embargo, los alergenos presentes en los extractos de heces también están presentes en los extractos somáticos, por lo que estos últimos pueden considerarse más completos. También hemos querido investigar qué alergenos están presentes en el aire en las salas de cultivo y manipulación de ácaros. Para ello, colocamos filtros para determinar la cantidad de alergeno que se recogía en el aire en las salas de cultivo y medimos niveles de Der p 1 y Der p 2 en estas muestras. Observamos que sin manipulación de los cultivos, y en condiciones de estabilidad, se detectaban cantidades muy bajas de alergenos. Estos valores aumentan drásticamente en el momento en que se ponía en marcha la maquinaria de tamización o manipulación (Tabla 1). Estos filtros fueron igualmente analizados por SDS-PAGE (Figura 5) e inmunoblots de IgE específica (Figura 6), identificándose los alergenos más importantes. Resultados similares se obtuvieron comparando extractos convencionales de cuerpos y de heces y filtros. De estos resultados se puede concluir que los extractos alergénicos de ácaros son uniformes y reproducibles en su composición y contienen alergenos somáticos y fecales. Además comprobamos que los alergenos de ácaros se encuentran en mayor concentración en el aire en condiciones de turbulencia o de agitación del reservorio. Es importante señalar la alta concentración de Der p 2 en los extractos fecales, alergeno que también es detectable en el aire durante los procesos de tamizado y sólo en condiciones de turbulencia, lo cual sugiere la importancia clínica de este alergeno.
Los extractos de ácaros se encuentran actualmente bien estudiados y estandarizados, y existen numerosos estudios que avalan la eficacia clínica de la inmunoterapia de estos extractos16, 17. Se puede decir que junto a las gramíneas, los ácaros pertenecen al grupo de alergenos cuya composición está mejor estudiada y estandarizada. Se han identificado y clonado más de 15 alergenos y demostrado la importancia clínica de la sensibilización a sus alergenos.

Extractos de epitelios
Todos los animales vertebrados pueden ser causantes de procesos de sensibilización al excretar proteínas o al acumularlas en las superficies del cuerpo. La tenencia de mascotas es una de las principales fuentes de alergenos que inducen alergia perenne en humanos. Los alergenos principales son los derivados del gato (Felis domesticus) y del perro (Canis familiaris). En los últimos años también se detectado un incremento en la prevalencia de la alergia a otros mamíferos incluyendo conejos y hámsters. Existen también procesos alérgicos que son causados por animales y que están estrechamente relacionadas con un tipo de asma ocupacional padecido por trabajadores en contacto con animales de laboratorio, especialmente roedores (rata y ratón). El resto de la población no suele padecer este tipo de alergias puesto que no entran en contacto con los alergenos desencadenantes de esta respuesta. Sin embargo, en Estados Unidos, la sensibilización a rata y ratón suele ser muy frecuente en niños asmáticos18. Al ser alergenos cuya principal vía de sensibilización es aérea, los síntomas más comunes producidos son principalmente rinoconjuntivitis y asma.
La mayoría de los alergenos de mamíferos descritos se engloban en la familia de las lipocalinas o de las albúminas, de ahí que exista reactividad cruzada entre los diferentes taxones19. Las lipocalinas son proteínas altamente solubles que están presentes en fluidos y secreciones, poseen de una a tres estructuras conservadas y su función es unir y transportar pequeños ligandos hidrofóbicos como vitaminas o feromonas. Sus características inmunológicas no son aún del todo conocidas20.
Gatos y perros son la principal fuente de alergenos en los hogares y la causa más común de sensibilizaciones alérgicas producidas por animales domésticos, especialmente los gatos21. Las cantidades de alergenos liberadas son importantes y su efecto se ve potenciado debido a los reservorios de alergenos que existen dentro de las casas (mantas, alfombras, sofás, etc.) donde se acumulan en grandes cantidades. Esto hace que los niveles se mantengan elevados incluso mucho tiempo después de retirar el animal22.
El alergeno más importante descrito en gato es una glicoproteína dimérica de 38 kDa secretada principalmente por las glándulas sebáceas que se acumula en la piel y el pelo23. Su producción está regulada hormonalmente y las concentraciones varían notablemente entre machos y hembras, siendo los primeros los que presentan los niveles más elevados de secreción24. Se ha demostrado que los machos reducen la producción de Fel d 1 de manera significativa tras la castración, siendo revertido el proceso cuando se les administra testosterona exógena. El papel fisiológico del Fel d 1 es desconocido pero debido a la relación con la función holocrina del gato se sospecha que puede estar implicado en la regulación de la secreción de lípidos, hecho que en parte estaría corroborado por la similitud del alergeno con proteínas de unión de esteroides. Se conoce que niveles de Fel d 1 inferiores a 100 ng/m3 de aire son capaces de inducir síntomas respiratorios. Recientemente, una cistatina ha sido identificada como alergeno de la piel (Fel d 3), encuadrado en la familia de los inhibidores de la cisteína proteasa25, 26.
    En perros se han descrito dos alergenos principales (Can f 1 y Can f 2) pertenecientes a la familia de las lipocalinas y con pesos de 25 y 27 kDa, respectivamente. Can f 1 es producido por las células epiteliales de la lengua y Can f 2 es secretado por las glándulas parótidas27. La albúmina ha sido igualmente descrita como alergeno importante en el perro.
Los roedores, especialmente ratas (Rattus norvegicus), ratones (Mus musculus), conejos (Orden Lagomorfa) y cobayas (Cavia sp)28, son responsables de un importante número de enfermedades alérgicas29 debido, especialmente, a la importancia que estos animales tienen en la investigación científica. En los últimos años, estos roedores están siendo introducidos como mascotas, junto con hámster (Mesocricetus auratus) y jerbos (Meriones unguiculatus), con lo que el número de sensibilizaciones aumenta cada año.
Las fuentes de estos alergenos se encuentran en saliva, piel, pelo y especialmente en orina. El hábitat típico de estos animales, en jaulas con material inerte, como viruta de madera, serrín o sepiolita favorece la acumulación de los alergenos en altas concentraciones. La elevada actividad metabólica de estos animales hace que se liberen grandes cantidades de alergeno. La presencia de reactividad cruzada entre las diferentes especies30 es otro hecho característico de este tipo de alergenos. Muchos de ellos tienen similitud con prealbúminas o albúminas y están encuadradas en la familia de las lipocalinas.
En ratón, el alergeno mayor (Mus m 1) se encuentra en la orina y tiene un peso aproximado de 18 kDa31. En rata se han descrito 3 alergenos mayores de 17 (Rat n 1), 21 y 23 kDa. Pero no solo la orina de estos animales parece ser fuente alergénica. Se ha descrito un alergeno de 29 kDa32 procedente del polvo de los animalarios de rata, compuesto principalmente de escamas dérmicas, piel y pelo, además de proteínas de la orina. Recientemente se han descrito también 3 alergenos de rata en la piel con pesos moleculares de 19/17 kDa, 26/23 kDa y 55/51 kDa y varios alergenos de menos de 22 kDa y otros dos de 66 y 43 kDa en saliva33. En cobaya el Cav p 1 y en conejo el alergeno Ory c 1 han sido descrito ambos alergenos y encuadrados en la familia de las lipocalinas.

Estandarización de epitelios
Un desafío importante es la correcta estandarización de los epitelios de mamíferos34, ya que, como hemos visto, existen muchos animales que pueden producir alergia y hay varias fuentes de alergenos, especialmente, epitelios y orina. Además, muchas de las moléculas implicadas en la alergia a animales están bajo control hormonal o son producto de su metabolismo, lo cual hace muy difícil conseguir una materia prima homogénea. Se ha demostrado que existe variabilidad alergénica según sea la fuente de materia prima que se utilice, pudiéndose obtener distintos patrones si los extractos provienen de pelo o de raspados de la piel. También pueden existir diferencias si la materia prima proviene de machos o de hembras, de animales con distinto color de pelaje, de animales adultos o jóvenes, e incluso según las razas o variedades. Incluso se ha sugerido que la dieta puede influenciar la alergenicidad de los gatos35. Todos estos aspectos están mejor estudiados en los gatos, donde se sabe que la producción de Fel d 1 está regulada hormonalmente36.
En la actualidad existe una cierta confusión en la nomenclatura de los extractos de mamíferos. Esta confusión es debida al uso de distintas materias primas etiquetando los extractos con los mismos nombres. En general se denominan extractos de epitelios, pero su procedencia puede ser diversa. Existen extractos cuya procedencia es el pelo, que es lavado en acetona y del cual se separan por tamizado las partículas que se encuentran adheridas a su superficie, y que son las que transportan la mayor cantidad de alergeno, especialmente Fel d 1. La materia prima resultante de desengrasar el pelo y recoger el material en un filtro contiene escamas (caspa, o "dander") y otras células de la epidermis. También existen los extractos de piel (epitelio). Estos extractos se preparan a partir de fragmentos de piel, incluyendo pelos, del animal. Este material puede haber sido desengrasado previamente y liofilizado. Estos extractos tienen una composición alergénica distinta, suelen ser menos potentes y tienen un mayor contenido de albúmina y otras proteínas séricas. Un grupo importante de alergenos que no ha sido estandarizado corresponde al grupo de las orinas, que pueden ser muy importantes en ciertos animales.
En los últimos años, hemos llevado a cabo un estudio para identificar la mejor materia prima de partida para fabricar extractos para diagnosticar la alergia al gato. Para ello se utilizó materia prima de diferentes procedencias, como pelo de varias compañías suministradoras, y epitelio. Los resultados demostraron perfiles diferentes según se tratara de una materia prima, u otra. Observamos que los extractos derivados del pelo son más potentes y contienen menos proteínas irrelevantes (Figura 7). Además, tienen un contenido mayor de Fel d 1 y han demostrado eficacia clínica en estudios a doble ciego controlados con placebo37.
Para establecer que tipo de extracto se debería usar para el diagnóstico y tratamiento de la alergia a los gatos, hemos realizado una serie de experimentos para determinar qué tipo de material se encuentra en suspensión en el aire. Analizamos las concentraciones de Fel d 1 en filtros recogidos en un estabulario donde se mantenía una gata en cautividad. Se detectaron niveles medios aproximadamente 5 ng/m3. Este valor se elevó bruscamente, más de 20 veces, durante la etapa del celo de la gata, hasta recuperar los valores habituales finalizado el ciclo estral38. Pruebas cutáneas realizadas con extractos de filtros recolectados en esa sala produjeron pruebas cutáneas positivas, aunque de menor tamaño que las producidas por un extracto estandarizados (Figura 8).
El caso de los extractos de epitelio de conejo es similar, existiendo diferencias entre extractos de conejos jóvenes y adultos. Los perfiles de conejos jóvenes contienen bandas de mayor peso molecular, mientras que los perfiles de los conejos adultos tenían bandas de menor peso molecular (Figura 10). Los resultados demostraron que los extractos de conejos adultos tenían una mejor capacidad diagnóstica in vivo que los conejos jóvenes a una concentración de prick inferior39.
Como conclusión general en este punto, podemos afirmar que los extractos de epitelios deben estar preparados a partir de una materia prima con unas características alergénicas similares a la que se inhala. Por lo tanto estos extractos deben proceder del lavado con acetona y posterior filtrado del pelo y, a ser posible, de animales adultos.

Conclusiones
Existen diferencias en los extractos alergénicos de diferentes compañías farmacéuticas. Estas pueden deberse a la selección adecuada de la materia prima, las diferencias en métodos, tiempos y soluciones de extracción, tamaño de poro de diálisis y a los métodos de valoración de los alergenos para asignarles una potencia biológica determinada. En la estandarización in vivo, es igualmente necesario unificar los criterios de selección de los pacientes para obtener resultados homogéneos. Los métodos de valoración, aunque el principio científico sea el mismo, deben ser uniformes y estar validados, de otra forma, estas variaciones pueden agravarse. Estos factores son igualmente aplicables para la cuantificación de alergenos mayores. El objetivo final de todos debe ser la obtención de extractos que sean consistentes y reproducibles, estables, y con eficacia clínica y seguridad demostrada para que los pacientes alérgicos sean tratados de una forma segura y eficaz.

Bibliografía

1.    Council Directive 89/342/EEC of 3 May 1989 extending the scope of Directives 65/65/EEC and 75/319/EEC and laying down additional provisions for immunological medicinal products consisting of vaccines, toxins or serums and allergens (OJ No L 142 of 25. 5. 1989)

2.    Allergen products (Producta allergenica). European Pharmacopeia 1997;1063-8.

3.     Berrens L. What is a major allergen?. Clin Exp Allergy. 1994; 24: 606-609.

4.     Furmonaviciene R, Shakib F. The molecular basis of allergenicity: comparative analysis of the three dimensional structures of diverse allergens reveals a common structural motif. J Clin Pathol: Mol Pathol 2001; 54: 155-159.

5.    Carnés J, Iraola V, Fernández-Caldas E. Alergenos. Módulo 3, Capítulo 8. En "Rinitis. Patología alérgica nasal". Soler R, Til G. Editorial Luzán 2002. ISBN: 84-7989-133-5. Dep. Legal: M-19806-2002.

6.    Esch RE. Allergen source materials and quality control of allergenic extracts. Methods. 1997;13(1):2-13.  

7.    Grier TJ, Hazelhurst DM, Duncan EA, West TK, Esch RE. Major allergen measurements: sources of variability, validation, quality assurance, and utility for laboratories, manufacturers, and clinics. Allergy Asthma Proc. 2002; 23(2):125-31.

8.    Fernández-Caldas E, Carnés J, Ferrer A, Casanovas M. Allergenicity of 10 apple varieties. J. Allergy Clin Immunol. 2005; 115 (2): S93.

9.    Carnés J, Fernández-Caldas E, Gallego MT, Ferrer A, Cuesta-Herranz J. Pru p 3 (LTP) content in peach extracts. Allergy. 2002;57(11):1071-5.

10.    Carnés Sánchez J, Iraola VM, Sastre J, Florido F, Boluda L, Fernández-Caldas E. Allergenicity and immunochemical characterization of six varieties of Olea europaea. Allergy. 2002 Apr;57(4):313-8.

11.    Fernández-Caldas E, Carnés J, Iraola V, Casanovas M. Comparison of the allergenicity and Ole e 1 content of six varieties of Olea europaea pollen collected during five consecutive years. 2005 Submitted for publication.

12.    Esch RE. Manufacturing and standardizing fungal allergen products. J Allergy Clin Immunol. 2004 Feb;113(2):210-5.

13.    Carnés J, Fernández-Caldas E, Boluda L, Casanovas M, Sastre J, Lluch Bernal M, Blanca M. Rapid release of Ole e 1 from Olive pollen using different solvents. Allergy 2002: 57: 798-804.

14.    Thommen AA. Hayfever. In: Coca AF, Walzer M, Thommen AA, editors. Asthma and Hayfever in Theory and Practice. Springfield, IL: CC Thomas, 1931:487-528.

15.    Fernández-Caldas E, Ochoa C, Iraola C, S Lafosse-Marin Differences between extracts derived from pure bodies or faeces of Blomia tropicalis. XXII EAACI Congress, Abstract Book 2003;90. [Abstract 283]

16.    Ferrer A, Garcia-Selles J. Significant improvement in symptoms, skin test, and specific bronchial reactivity after 6 months of treatment with a depigmented, polymerized extract of Dermatophagoides pteronyssinus and D. farinae. J Investig Allergol Clin Immunol. 2003;13(4):244-51.  

17.    Ameal A ,Vega-Chicote JM, Fernández S, Miranda A, Carmona MJ, Rondón MC, Reina E,García-González JJ.Double-Blind and Placebo-Controlled Study to Assess Efficacy and Safety of a Modified Allergen Extract of Dermatophagoides pteronyssinus in Allergic Asthma. Allergy 2005; In press.

18.     Matsui EC, Wood RA, Rand C, Kanchanaraksa S, Swartz L, Eggleston PA. Mouse allergen exposure and mouse skin test sensitivity in suburban, middle-class children with asthma. J Allergy Clin Immunol. 2004 May;113(5):910-5.

19.    Cabanas R, Lopez-Serrano MC, Carreira J, Ventas P, Polo F, Caballero MT, Contreras J, Barranco P, Moreno-Ancillo A. Importance of albumin in cross-reactivity among cat, dog and horse allergens. J Investig Allergol Clin Immunol 2000; 10(2):71-77.

20.    Virtanen T, Zeiler T, Mantyjarvi R. Important animal allergens are lipocalin proteins: why are they allergenic? Int Arch Allergy Immunol 1999; 120(4):247-58.

21.    Wood RA, Laheri AN, Eggleston PA. The aerodynamic characteristics of cat allergen. Clin Exp Allergy 1993; 23(9):733-739.

22.    Wood RA, Chapman MD, Adkinson NF, Eggleston PA. The effect of cat removal on allergen content in household dust. J Allergy Clin Immunol. 1989; 83: 730-735.

23.    Morgenstern J, Griffith I, Brauer A, Rogers B, Bond J, Chapman M, Kuo M. Amino acid sequence of Fel d 1, the major allergen of the domestic cat: Protein sequence analysis and cDNA cloning. Prot Natl Acad Sci. 1991; 88: 9690-9694.

24.     Ramadour M, Birnbaum J, Magalon C, Lanteaume A, Charpin D, Vervloet D. Cat sex differences in major allergen production (Fel d 1). J Allergy Clin Immunol. 1998; 101: 282-284.

25.     Ichikawa K, Vailes LD, Pomes A, Chapman MD. Molecular cloning, expression and modelling of cat allergen, cystatin, a cysteine protease inhibitor. Clin Exp allergy. 2001; 31(8): 1279-1286.

26.     Ichikawa K, Vailes LD, Pomes A, Chapman MD. Identification of a novel cat allergen-cystatin. Int Arch Allergy Immunol. 2001; 124; 55-56.

27.     Konieczny A, Morgenstern JP, Bizinkauskas CB, Lilley CH, Brauer AW, Bond JF, Aalberse RC, Wallner BP, Kasaian MT. The major dog allergens, Can f 1 and Can f 2, are salivary lipocalin proteins: cloning and immunological characterization of the recombinant forms. Immunology. 1997; 92(4): 577-586

28.     Walls AF, Newman Taylor AJ, Longbottom JL. Allergy to guinea pigs: Allergic activities of extracts derived from the pelt, saliva, urine and other sources. Clin Allergy. 1985; 15: 241-251.

29.     Gautrin D, Infante-Rivard C, Ghezzo H, Malo JL. Incidence and host determinants of probable occupational asthma in apprentices exposed to laboratory animals. Am J Respir Crit Care Med. 2001; 163(4): 899-904.

30.     Gordon S, Welch JA, Tee RD. Allergenic cross-reactivity between rat and mouse urine, Clin Exp Allergy. 1994; 24: p43.

31.     Lorusso JR, Moffats S, Ohman JL. Immunologic and biochemical properties of the major mouse urinary allergen (Mus m 1). J. Allergy Clin Immunol. 1986; 78: 928-937.

32.     Gordon S, Tee RD, Newman Taylor. Analysis of the allergenic composition of rat dust. Clin Exp Allergy. 1996; 26: 533-541.

33.     Gordon S, Tee RD, Stuart MC, Newman Taylor AJ. Analysis of allergens in rat fur and saliva. Allergy 2001; 56 :563-567.

34.    Fernández-Caldas E, Carnés J, Iraola V. "Alergenos de interior". En: Quirce Gancedo S, Carrillo Diaz T, Olaguibel Rivera JM: "Asma" Vol. I (Capitulo 10). MRA Ediciones, Barcelona. Depósito Legal: B-47.797-2004; 2004

35.     Arlian LG, Morgan MS, Neal JS, Vyszenski-Moher DL, Tetrick MA. Influence of Diet on Fel d 1 Production by Cats. J Allergy Clin Immunol 2005; S236; Abstract 940.

36.    Zielonka TM, Charpin D, Berbis P, Luciani P, Casanova D, Vervloet D.  Effects of castration and testosterone on Fel d 1 production by sebaceous glands of male cats: Immunological assessment. Clin Exp Allergy 1994; 24(12):1169-73.

37.    González E, Berges P, Aragoneses E, Martín C, Álvarez-Cuesta E. Efficay and safety of a standardised sublingual therapeutic vaccine of cat epithelial extract. J Allergy Clin Immunol 2003;111(2):S200. [Abstract]

38.    Marañón F, Fernández-Caldas E, Casanovas M, Clavijo JJ, Álvarez-Cuesta E, Gonzalez-Mancebo E, Berges P. Sharp Increase in Fel d 1 Airborne Levels During the Estrus Cycle of a Cat. J Allergy Clin Immunol 2002, (109, part 2). [Abstract]

39 .    Pagán JA, Toledo RF, Ramírez M, Hernández J, Casanovas M, Fernández-Caldas E. Caracterización alergénica de 2 extractos de conejo. Alergol  Inmunol Clin; 2004;  19 (Ext 2): 304.