Estandarizaciones de alergenos en España

MODERADOR:
Dr. José M. Olaguibel.
Hospital Virgen del Camino. Pamplona.

TÉCNICAS DE ESTANDARIZACIÓN III.
Estandarización biológica de extractos alergénicos: Platanus acerifolia como modelo
A. Martínez, J. A. Asturias 
Bial-Arístegui, Departamento de I+D, Bilbao.

Abstract
La estandarización biológica de extractos alergénicos se realiza con el objetivo de mejorar los preparados usados clínicamente en el diagnóstico y tratamiento de alergias. Este proceso comprende el establecimiento de un extracto de referencia con el que se comparan todos los lotes fabricados del mismo alérgeno. La comparación se realiza por un conjunto de técnicas inmunoquímicas que en esta presentación se ejemplifican mediante el modelo del pólen de Platanus acerifolia. En el afán de caracterizar al detalle el extracto se describieron por primera vez sus dos alérgenos principales, que fueron denominados como Pla a 1 y Pla a 2, correspondientes a proteínas con 18 y 43 kDa y con actividades enzimáticas inhibidora de invertasa y poligalacturonasa, respectivamente. Cada uno de estos alérgenos es responsable de más del 50% de la capacidad fijadora de IgE de los sueros de pacientes monosensibles a Platanus, por lo que estamos ante un modelo de gran interés para el uso clínico de alérgenos individuales.

Introducción
La estandarización biológica de extractos alergénicos constituye, hoy por hoy, el mejor procedimiento aplicable para asegurar la calidad de estos productos en su utilización clínica, tanto en diagnóstico, como en tratamiento. El objetivo de dicho proceso es el de establecer un prototipo que debe ser caracterizado detalladamente y valorado en su actividad en pacientes alérgicos, al cual se deberán asemejar todos los lotes que se elaboren del mismo extracto, consiguiendo de este modo una fabricación consistente, en términos de homogeneidad, que permita prever el efecto del producto terminado, consiguiendo un alto nivel de seguridad y eficacia en su utilización.
El proceso de caracterización del extracto, que constituye un elemento clave en el proceso de estandarización biológica, puede ser de tal calibre que, en casos extremos, podría contribuir a aportar nuevos conocimientos a la comunidad científica, tales como la identificación de sus alérgenos mayores incluyendo el conocimiento de sus características estructurales y funcionales: este ha sido el caso del extracto alergénico del polen de Platanus acerifolia.
Desde que en 1980 comenzara a aplicarse el concepto de estandarización biológica a la producción de extractos comerciales, las distintas compañías fabricantes nos hemos esmerado en ir ampliando el panel de alérgenos disponibles en unidades biológicas (es decir, como preparaciones estandarizadas biológicamente), que han ido sustituyendo a los elaborados utilizando otros sistemas de estandarización (peso/volumen, unidades Noon, contenido proteico, etc.) como base. Y el criterio para priorizar la incorporación de cada tipo de extracto alergénico a su nuevo estatus de "biológicamente estandarizado" ha sido el de su relevancia etiológica, tanto por la necesidad de utilización clínica de un producto de calidad que aplicar a una causa con alto nivel de prevalencia, como por la mayor facilidad para encontrar una muestra poblacional que cumpliera los criterios de inclusión del programa de estandarización.
El polen de Platanus acerifolia es una fuente alergénica con indudable relevancia en nuestro entorno y por ello su estandarización biológica constituyó un objetivo de desarrollo hace ya algunos años.

El polen de Platanus como fuente alergénica
A diferencia de lo que ha ocurrido con otros pólenes, los alérgenos de P. acerifolia no se han caracterizado con precisión hasta los últimos tres años. Quizás una de las causas sea que este polen sólo posee una presencia ambiental significativa en España, donde es más importante su nivel de contajes  atmósféricos, no siendo tan importante en el resto del mundo, quizás exceptuando algunas zonas de Francia e Italia.
Como antecedentes, se puede citar que en 1977 un grupo clínico de Marsella, mencionó la hipersensibilidad  a este polen, describiendo un alérgeno de 22 kDa (1). En España, en 1999, Valero y colaboradores (2), publicaron un trabajo en el que se estudiaba de la alergia a Platanus y se aportaba alguna característica preliminar de alguno de sus alérgenos. Posteriormente, en sendos estudios de Subiza y colaboradores (3, 4),  se destacó la importancia clínica del polen de Platanus, su presencia ambiental y el efecto de sensibilización de pacientes alérgicos, incluso se realizó una descripción inicial de algunos alérgenos mayores, con un avance de sus pesos moleculares, que se han visto  ratificados con las posteriores investigaciones.
Nuestro primer contacto con el estudio de los alérgenos de P. acerifolia se produjo 1996, con la participación en estudios planteados por los Drs. Olivé y Vives (5), para posteriormente, allá por el año 2000, y gracias al interés mostrado por otros grupos clínicos, reemprender un trabajo más importante de investigación sobre este polen.
En general, se puede decir que no era mucho lo que se conocía para la importancia clínica que podía tener este polen, este hecho y la necesidad de poner a disposición del especialista en alergia un producto de calidad reproducible, fue lo que nos animó a emprender un programa de estandarización biológica incluyendo una caracterización detallada de los alérgenos del polen de P. acerifolia.

Platanus acerifolia: características generales
Platanus acerifolia es un árbol caducifolio, que pertenece a la familia Platanaceae. Es una especie híbrida formada a partir de Platanus orientalis de origen euroasiático y  Platanus occidentalis de origen americano. Presenta sinonimia con Platanus hibrida y Platanus hispanica (se dice que el Platanus hispanica procede de una nueva hibridación para dar lugar a especies más resistentes a la contaminación).
Este árbol tiene su origen en los Balcanes y fue traído a España por los romanos, como árbol ornamental para dar sombra en los caminos y paseos, y para repoblación urbana en definitiva, entre otras cosas porque es un árbol, que además de tener un porte elegante, es resistente a la contaminación.
En cuanto a sus hojas, lo más característico es que son alternas, palmeadas, con 5 o 7 lóbulos, de un color verde brillante y con un envés más claro. Sus frutos son globulares, pilosos, agrupados,  y con un diámetro medio de unos 4 cm. La corteza es inicialmente parda y después va formando láminas delgadas que se desprenden y dejan en el tronco manchas amarillas.
La polinización de P. acerifolia tiene lugar en marzo y abril, también se detectan algunos contajes de este polen en septiembre y octubre, este rebrote se supone que es debido a pólenes que quedan en las hojas y que llegan en parte a la atmósfera cuando se producen la caída de éstas.
El polen se presenta en un pequeño tamaño entre 18 a 25 micras en sus ejes, es un polen oblado esferoidal,  es decir con forma de balón de rugby pero tumbado, es trizonocolpado, es decir tiene 3 aberturas longitudinales.
Su presencia en la atmósfera de las distintas ciudades Españolas puede llegar a alcanzar valores tan importantes como los registrados en el 2004 (figura 1), en Zaragoza (más de 10 000 granos/m3), Barcelona (6 000 granos/m3) o Madrid (por encima de los 3 000).
Platanus en comparación con otros pólenes abundantes en la atmósfera muestra una menor capacidad de sensibilización (4). Así, en la atmósfera de Madrid donde se encuentra en un promedio del 17% del total de pólenes (de los cuales un 60 % de las cuentas de pólenes de Platanus se obtienen en los meses de marzo y abril), presenta una sensibilización del 52% (prick), mientras que otras especies, como por ejemplo, gramíneas de la familia Poaceae con un 13% en atmósfera alcanzan niveles de sensibilización del 85%. Olea con sólo un 8% presenta un nivel de sensibilización del 61% y, por ejemplo, Plantago con un 3% de presencia relativa de polen en la atmósfera da lugar a un 53% de prevalencia de sensibilización en polínicos.
En Barcelona, en la que el perfil de evolución en los últimos años de la presencia de Platanus es más acusado por la mayor  repoblación con este árbol, llegándose a superar el 20% del valor relativo de pólenes de Platanus en la atmósfera, sin embargo sólo ha evolucionado en prevalencia de sensibilización desde el 6 hasta el 13%. Esta diferencia quizás podría deberse a una mayor presión ambiental de polen de gramíneas que hay en Madrid respecto a Barcelona  y a una posible reactividad cruzada que se ha evaluado respecto al polen de la gramínea Dactylis glomerata (4). En el caso de Platanus, la prevalencia de sensibilización clínica también es menor que en otros pólenes, pero es importante al fin y al cabo. Estos niveles de sensibilización clínica oscilan entre el 3,6% (5) y el 28% (6). Todo esto quiere decir que, aunque la alergenicidad, o la capacidad sensibilizante del polen de Platanus no es la misma que la de algunos pólenes de otras especies, es, sin embargo lo suficientemente importante, como para que se necesiten extractos de calidad que puedan servir para diagnosticar y tratar adecuadamente a este grupo de pacientes.

Estandarización biológica de Platanus acerifolia
Se elaboró un extracto de acuerdo a una metodología convencional, cuya actividad alergénica fue valorada mediante pruebas cutáneas de prick, de acuerdo a los procedimientos descritos por la EAACI (Academia Europea de Alergia e Inmunología Clínica) (7). Se reclutaron 31 pacientes para el estudio, que cumplieron los criterios de inclusión definidos por S. Dreborg (8). Tras la cuantificación de su actividad biológica, el extracto fue almacenado en alícuotas liofilizadas y etiquetado como referencia interna (IHR). La curva dosis respuesta permitió estimar el valor SPT (concentración que dió lugar a una pápula equivalente a la de histamina) que posibilitó la adjudicación de unidades biológicas a la mencionada referencia, que a partir de entonces sería utilizada para ajustar la potencia y composición de los lotes fabricados, mediante métodos basados en la utilización de los sueros (IgE) de los pacientes (9). La caracterización cualitativa de los extractos se realizó mediante técnicas electroforéticas y de immunoblotting. La figura 2 muestra el patrón electroforético del extracto obtenido mediante isoelectroenfoque (IEF), pudiéndose observar una que una mayoría de las proteínas presentaban un carácter acídico, con pI en el rango 3,5 - 6,5, pero detectándose también la presencia de proteínas básicas en la región próxima al cátodo (9,3). El revelado de las proteínas transferidas a membrana por incubación con una mezcla de los sueros de los pacientes incluidos en el estudio mostró una intensa fijación de IgE a nivel de la banda proteica básica y más leve en la región ácida.
La figura 3 muestra el patrón de bandas obtenido en SDS-PAGE y en el subsiguiente immunoblotting tras incubación con la mezcla de pacientes incluidos en programa de estandarización (mono y polisensibilizados). Se observó un alto número de proteínas fijadoras de IgE de masas moleculares inferiores a 97,0 kDa
Sin embargo, cuando las proteínas transferidas fueron incubadas con una mezcla de sueros correspondiente sólo a los pacientes monosensibilizados se encontró un esquema de dos alérgenos fundamentales (Figura 4), detectados a 18 y 43 kDa, con una movilidad algo menor en condiciones no reductoras. Estas dos bandas corresponderían a los alérgenos denominados Pla a 1 y Pla a 2, que fueron caracterizados en profundidad en los estudios subsiguientes.
El ajuste de la potencia de los extractos se realizó mediante EAST-Inhibición. En el ejemplo de la figura 5 se observan las rectas de inhibición obtenidas con el extracto de referencia y con un lote de fabricación. La relación entre los parámetros UI50 de las dos rectas permite conocer la potencia relativa de ambos extractos para proceder al ajuste de concentración que permita mantener la consistencia en la actividad de los productos destinados al diagnóstico y tratamiento de la alergia a P. acerifolia.

Pla a 1
El estudio de este alérgeno abordó inicialmente su purificación y caracterización (10). Un extracto de P. acerifolia fue fraccionado usando tres pasos cromatográficos: intercambio iónico, tamizado molecular y fase reversa. Las fracciones resultantes fueron analizadas por EAST (enzimoallergosorbent test), SDS-PAGE, isoelectroenfoque, immunoblotting y secuenciación de aminoácidos. Como resultado se purificó una proteína de 18 kDa, que fue denominada Pla a 1. Se trataba de una proteína no glicosilada, con un punto isoeléctrico mayor de 9,3, que era reconocida por el 92% de los pacientes alérgicos a Platanus monosensibilizados y por el 83% de los polisensibilizados.
Posteriormente, el ADNc de Pla a 1 fue clonado por transcripción inversa seguido de PCR utilizando secuencias de péptidos obtenidos por digestión con tripsina (11). La secuencia codificante de Pla a 1 fue subclonada en el vector de expresión pKN172 y expresada en Escherichia coli como una proteína no fusionada. La capacidad fijadora de IgE de la proteína recombinante así obtenida fue valorada por métodos inmunoquímicos. Pla a 1 captó IgE del suero del 83% de los pacientes y representó el 60% de la capacidad fijadora de IgE total del extracto de P. acerifolia. El análisis de su secuencia demostró que Pla a 1 pertenece a una nueva clase de alérgenos relacionados con los inhibidores de invertasas. La forma recombinante mostró características inmunoquímicas semejantes a las de su contrapartida natural.

Pla a 2
Recientemente hemos estudiado también el segundo alérgeno importante para los pacientes monosensibilizados a P. acerifolia, Pla a 2 (12). El alérgeno fue purificado con una combinación de cromatografías de intercambio iónico y tamizado molecular. Se comprobó que Pla a 2 es una glicoproteína con una masa molecular de 43 kDa y un punto isoeléctrico de 9,3. Fue detectado por la IgE del suero de un 84% de los pacientes alérgicos a P. acerifolia y representaba un 52% de la capacidad fijadora de IgE total del extracto. El clonaje de su ADNc a partir de secuencias de péptidos internos permitió conocer su homología de secuencia con poligalacturonasas conocidas de pólenes y frutas. Adicionalmente se corroboró que Pla a 2 tenía esta actividad enzimática.

Perspectivas futuras
El de P. acerifolia es uno de aquellos casos en que el término alérgeno mayor (o lo que realmente debiera ser este término) cobra su mayor sentido, puesto que prácticamente con sólo dos alérgenos importantes en términos de frecuencia de reconocimiento, se pueden captar la mayoría de las IgE específicas a este polen presentes en el suero de los individuos monosensibilizados a él. Esto puede suponer que nos encontremos frente a un modelo en el que la utilización de dos moléculas alergénicas definidas puedan ser suficientes para el diagnóstico y tratamiento de los pacientes que sufren de hipersensibilidad a un polen que está incrementando su relevancia clínica, como es el del plátano de sombra, P. acerifolia.

Bibliografía
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3. SUBIZA J, CABRERA M, VALDIVIESO R et al. Seasonal asthma caused by airbone Platanus pollen. Clin Exp Allergy 1994;14:220-226.
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6. SUBIZA J, JEREZ M, GAVILÁN M.J, VARELA S, RODRÍGUEZ R, NARGANES M.J. ¿Cuáles son los pólenes que producen polinosis epidémica en Madrid?. Rev Esp Alergol Immunol 1998;4:107-119.
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11. ASTURIAS J.A, IBARROLA I, ERASO E, ARILLA M.C, MARTÍNEZ A. The major Platanus acerifolia pollen allergen Pla a 1 has sequence homology to invertase inhibitors. Clin Exp Allergy 2003;33:978-985.
12. IBARROLA I, ARILLA M.C, MARTÍNEZ A, ASTURAS J.A. Identification of polygalacturonase as a major allergen (Pla a 2) from Platanus acerifolia pollen. J Allergy Clin Immunol, 2004;113:1185-1191.