Redes Temáticas de Investigación Colaborativa: Un nuevo horizonte en la investigación de la alergia a alimentos de origen vegetal

INTRODUCCIÓN: Albúminas 2S como proteínas alergénicas
Desde comienzos del pasado siglo se vienen describiendo casos de alergia a vegetales que contienen albúminas 2S. Sin embargo, el reconocimiento de estas proteínas como los alergenos responsables en esas fuentes biológicas ha sido más reciente, cuando Youle y Huang demostraron que los alergenos presentes en las semillas de algodón pertenecían a esta familia de proteínas. Desde entonces, se ha demostrado la responsabilidad de numerosas albúminas 2S en casos de alergia tipo I.
El término ALBÚMINA se ha utilizado desde primeros del siglo pasado para denotar proteínas que presentan una marcada solubilidad en agua pura, y frecuentemente coagulables por el calor (1924, Osborn). Este término se continuó utilizando de forma genérica hasta que los estudios de Youle & Huang in 1981, utilizando técnicas de centrifugación, demostraron que existían varios tipos de proteínas de almacenamiento en las semillas. Estas proteínas podían ser categorizadas por su coeficiente de sedimentación: 2S, 7S, 11S.
En 1910 Schern describe la alergia a ricino en animales, y en 1914, Alilaire atribuye su asma al  ricino: es el primer dato de alergia en el hombre debida a una harina de semillas. Dos décadas más tarde, Grabar y Koutself, en el Instituto Pasteur de París, demuestran que el alergeno es distinto de la toxina. Desde entonces, se han caracterizado 12 albúminas 2S como alergenos relevantes.

Alergia a mostazas: aspectos clínicos
    La mostaza es una de las especias más alergénicas de las que se tiene constancia hasta la fecha, tanto por su prevalencia como por la potencia alergénica. Como para otros alimentos alergénicos, la sensibilización depende de los hábitos alimentarios de la población. Existen varios tipos de mostazas: amarilla, negra y oriental, y se utilizan con distinta asiduidad en diferentes ámbitos geográficos. Los países más fuertemente consumidores de mostaza son USA, Francia y Japón. La mostaza es un frecuente condimento que puede encontrarse en salsas variadas y diferentes aliños, currys, mayonesas, vinagretas, en el mismo ketchup, o como aromatizante, y a menudo está oculta en alimentos en los que no se da razón de su presencia. En general, su acceso al cuerpo humano es por ingestión, pero se han descrito casos de alergia a mostaza por inhalación o contacto con la harina molturada.
    Los síntomas de los pacientes afectados por alergia a mostaza son típicos de las alergias alimentarias, tales como urticaria, eczema, asma bronquial, dolor gástrico, y puede llegar a ocasionar shock anafiláctico. La severidad de los síntomas ha llevado a algunos autores a desaconsejar el uso de los tests de provocación oral para evitar la aparición de reacciones sistémicas indeseables.
    En un estudio realizado en Francia en el año 2000, y utilizando 722 pacientes alérgicos a alimentos, Rance y colaboradores encontraron que, en los últimos años, se había desarrollado un notable incremento de la alergia a mostaza en ese país. Calcularon que afectaba entonces a más del 10% de los pacientes alérgicos a alimentos, y por tanto se encontraba entre los cinco alimentos responsables de más casos de alergia, después de los huevos, cacahuete, leche y bacalao. Finalmente, observaron que la alergia a esta especia comienza en los primeros años de la vida del paciente. Los autores concluyen la comunicación advirtiendo de que la mostaza debe ser incluida sistemáticamente en los tests de alergia a alimentos.

Sin a 1: alergeno principal de la mostaza amarilla (Sinapis alba L.)
    Sin a 1 es el alergeno principal de la mostaza amarilla, reconocido durante más de 17 años. Fue la primera albúmina 2S para la que se demostró de manera precisa su alergenicidad. Y, además, fue el primer alergeno de alimento producido de forma recombinante por medio de las técnicas de la Biología Molecular. Los estudios sobre este alergeno representan un claro ejemplo de investigación multidisciplinar. Comenzó con la colaboración entre nuestro grupo y el Servicio de Alergia del Hospital Ramón y Cajal, con los Dres. I. Moneo y J. Domínguez. Más tarde, la participación del grupo del Prof. M. Rico del Instituto Rocasolano permitió el análisis de la estructura tridimensional de esta proteína y, finalmente, la incorporación del Servicio de Alergia de la Fundación Jiménez Díaz (Dr. J. Cuesta) ha permitido continuar los estudios inmunológicos con dicha proteína... y otros alergenos de la mostaza.
    Sin a 1 posee propiedades moleculares y fisicoquímicas comunes a otras albúminas 2S así como a numerosos alergenos de alimentos: i) gran solubilidad en medios acuosos, ii) pequeño tamaño molecular, y a menudo: iii) estabilidad frente al calor y iv) proteasas. Además, el alergeno de mostaza es una estructura compacta y capaz de interaccionar con bicapas lipídicas. Estos datos estarían de acuerdo con la hipótesis de que los alergenos de alimentos deben exhibir suficiente estabilidad frente a digestión gástrica como para ser capaces de alcanzar la mucosa intestinal donde serían absorbidos y posteriormente sensibilizar al individuo. La estabilidad frente a proteasas se ha demostrado para otros alergenos de alimentos como son las LTPs, importantes en la alergia a frutas y ciertos vegetales. Precisamente se ha sugerido que esta propiedad podría ser utilizada para predecir una potencial alergenicidad en productos biológicos de consumo humano.
    La estructura 3D de Sin a 1 no ha sido determinada, pero sí la de BnIb, una albúmina 2S de Brassica napus (colza) -semilla muy relacionada taxonómicamente con la mostaza-. Se trata de una proteína homóloga de Sin a 1, y para la que se ha demostrado recientemente su alergenicidad. Su conformación posee muy alto contenido de hélice ? y una región prominente poco estructurada. Es interesante destacar que un patrón estructural muy similar lo presentan otros alergenos de alimentos como son las LTPs, o los inhibidores de alfa-amilasas. Por otro lado, se ha identificado en Sin a 1 un epítopo alergénico, que está situado precisamente en la región prominente de su estructura que, dado que coincide con una zona de secuencia de aminoácidos muy variable dentro de la familia de las albúminas 2S, se ha denominado "región hipervariable". Esto podría explicar la ausencia de reactividad cruzada observada entre estas proteínas.

Identificación de un nuevo alergeno principal en mostaza amarilla: la globulina 11S
    Pero las semillas de mostaza poseen más alergenos relevantes. Gracias a la colaboración establecida con el Dr. J Cuesta (Fundación Jiménez Díaz, Madrid), se pudieron detectar nuevas bandas de proteínas captadoras de IgE en la inmunotransferencia del extracto proteico de la harina de mostaza, cuando se teñían las alícuotas con sueros de individuos alérgicos a esta semilla. Muchos de los síntomas que sufrían estos pacientes eran propios de una alergia alimentaria: síndrome de alergia oral, urticaria, diarrea, anafilaxis, etc., y algunas reacciones obtenidas en las pruebas cutáneas resultaban muy intensas. La mayor parte de los pacientes eran también polínicos. En sus alergogramas se detectaba Sin a 1 (14.2 kDa) y, además, una banda de alto PM (alrededor de 52 kDa) muy frecuente y reactiva.
    Para analizar el nuevo alergeno, se sometió una muestra de extracto de harina de mostaza amarilla a una separación bidimensional mediante electroforesis y enfoque isoeléctrico, y después se hizo reaccionar con el reactivo de proteínas Azul de Coomasie (CBS). Una alícuota similar fue transferida a membranas de nitrocelulosa y teñida con los sueros de pacientes alérgicos para detectar su reactividad a los anticuerpos IgE. Así, se revelaron   varias bandas que fueron sometidas a un análisis de secuencia por espectrometría de masas. Se obtuvieron cuatro péptidos que, junto con la secuencia recogida por degradación de Edman de la proteína completa, permitió identificar a la molécula como una globulina 11S.

Aislamiento y caracterización de Sin a 2
    El nuevo alergeno fue aislado y analizado: posee un peso molecular de 52 kDa y contiene dos cadenas polipeptídicas diferentes que, después de someter la proteína a un tratamiento con agentes reductores, pueden separarse por cromatografía líquida de alta resolución (HPLC) en fase reversa. La cadena pesada exhibe mayor reactividad frente a los sueros de pacientes alérgicos que la ligera, lo que podría indicar que posee mayor número de epítopos, o que estos epítopos presentan mayor afinidad hacia las IgEs. El nombre asignado al alergeno es Sin a 2. La existencia de dos cadenas polipeptídicas en la proteína estaría de acuerdo con el hecho de que se trate de una globulina 11S, pues estas proteínas son hexámeros cuyos monómeros constituyentes están formados por dos tipos de subunidades: una mayor de alrededor de 32 kDa y una menor de 20 kDa, las cuales proceden de un  precursor común que se escinde por proteolisis.
    Los ensayos inmunológicos realizados con la proteína purificada son, hasta el momento, preliminares. Sin a 2 es reconocida por los sueros de pacientes alérgicos a mostaza, con distinta intensidad dependiendo de la reactividad de sus IgEs -algunos pacientes no poseen IgEs reactivas a Sin a 2-,  y hemos observado que existen diferencias perceptibles de reactividad dependiendo de la técnica con la que se detecta la interacción antígeno-anticuerpo, lo que hace pensar en una exhibición de epítopos alergénicos diferente cuando la proteína está desnaturalizada que cuando se encuentra en forma nativa.  
    Por otro lado, se ha determinado la importancia relativa que tienen los dos alergenos Sin a 1 y Sin a 2 en la reactividad de los pacientes a la mostaza. Se realizó mediante ensayos de inhibición en ELISA cuyas placas se habían tapizado con extracto total. Se utilizaron sueros individuales de pacientes alérgicos, con diversos valores de IgE específica a Sin a 2. El resultado indica que, independientemente del nivel de anticuerpos IgE que posean los pacientes frente a uno u otro alergeno, ambos presentan gran importancia clínica, y juntos pueden llegar a ser responsables de más del 90% de la sensibilización a mostaza.

Secuencia de Sin a 2
    Conocida la secuencia de algunos péptidos del nuevo alergeno -que habían permitido identificar a la proteína-, se podía abordar su clonaje y la secuenciación completa de su cDNA a través de las técnicas de la Biología Molecular. En efecto, utilizando los sistemas adecuados se obtuvo la secuencia de nucleotidos y, deducida de ella, la de la cadena polipeptídica correspondiente: la proteína posee 500 aminoácidos y un péptido señal de 23 residuos que son eliminados durante su biosíntesis en la célula y no aparecen en la proteína presente en la semilla. Las secuencias de aminoácidos de las globulinas 11S tienen un sitio de posible ruptura en un dipéptido Asn-Gly, por donde se ha predicho que las estas proteínas se escinden proporcionando las dos subunidades. Esta secuencia la encontramos también en Sin a 2, se encuentra en las posiciones 310-311, y daría lugar a dos cadenas, una de 32 kDa y otra de 20 kDa, lo que estaría de acuerdo con los datos experimentales obtenidos para Sin a 2. La molécula tiene 6 cisteínas, dos de las cuales han de estar implicadas en un  puente disulfuro, pues para separar las cadenas hay que tratarla con un agente reductor.
    La disponibilidad de la secuencia de una proteína posibilita su comparación con otras homólogas de la misma familia, y así sacar conclusiones a cerca de una posible compartición de regiones antigénicas y por lo tanto de reactividad cruzada. Se han descrito globulinas 11S en cacahuete (Ara h 3), avellana (Cor a 9), anacardo (Ana o 2), nuez del Brasil (Ber e 2), sésamo y soja. Las secuencias de aminoácidos de estas cupinas se conocen, y ello nos permite especular sobre la correspondencia de regiones antigénicas con Sin a 2.  Es interesante observar que existen regiones se secuencia muy parecida o idéntica, que alternan con segmentos característicos de cada proteína. Sin a 2 posee un región rica en Gln y Gly que no está presente en ninguna otra globulina 11S conocida.
    En cuanto a los posibles determinantes antigénicos presentes en Sin a 2, se ha realizado un análisis teórico de probabilidad de antigenicidad a lo largo de la secuencia de la proteína, y se han obtenido varias regiones como candidatas favorables a poseer esta propiedad. Tres de estos segmentos -señalados con flechas- coinciden con regiones del alergeno de cacahuete, Ara h 3, que han sido descritas como implicadas en epítopos alergénicos. La similitud de secuencia en dos de estas regiones podría dar cuenta de la existencia de reactividad cruzada entre Sin a 2 y Ara h 3, e incluso, quizás, con los alergenos procedentes de otras semillas alergénicas como las que se han mencionado más arriba, aunque esta circunstancia debe comprobarse experimentalmente en un futuro.
    Estos trabajos han sido financiados por los proyectos SAF 2002-02711 del Ministerio de Ciencia y Tecnología, así como por la Red Temática de Investigación Cooperativa de Alergia a Alimentos (G03/094, Fondo de Investigaciones Sanitarias, Ministerio de Sanidad y Consumo), y realizados por el grupo de "Alergenos" del Dpto. de Bioquímica y Biología Molecular I de la Universidad Complutense de Madrid, en colaboración con los Servicios de Alergia de la Fundación Jiménez Díaz y el Hospital Ramón y Cajal de Madrid, así como con el Grupo de Estructura Molecular del Instituto Rocasolano del CSIC de Madrid.

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