En primer lugar hablaremos de la IDENTIFICACIÓN Y CARACTERIZACIÓN DE POLIMORFISMOS PREVIAMENTE DESCRITOS, es decir, de aquellos polimorfismos sobre los cuales disponemos de algún estudio previo en el que se detalla su localización exacta en el genoma.

El primer paso en el diseño de estos estudios genéticos es elegir un GEN CANDIDATO, es decir, un gen que sospechamos desempeña una función importante en el desarrollo del fenotipo alérgico. Nuestra hipótesis de partida es la siguiente:

- Si este gen interviene en el desarrollo de la enfermedad,  la presencia de pequeñas variaciones en su secuencia nucleotídica (polimorfismos) pueden dar lugar a una alteración de su función (al menos parcialmente) y esta alteración podría influir en la aparición del fenotipo alérgico.

Los pasos a seguir a la hora de caracterizar un polimorfismo ya descrito son :

- EXTRACCIÓN DE ADN GENÓMICO de cada uno de los pacientes a analizar

Muchos centros disponen ya de aparatos de extracción automática de ADN, en los centros en los que no se dispone de este tipo de aparatos la alternativa es realizar una extracción manual del ADN de cada paciente mediante la utilización de distintos kits comerciales. Estos kits son muy parecidos entre si, se decide emplear uno u otro en función del tipo de muestra a partir de la cual queramos extraer ADN (sangre, saliva, semen....).

- Amplificación de nuestro gen problema mediante la REACCIÓN EN CADENA DE LA POLIMERASA (PCR)

Una vez que disponemos del ADN genómico de cada uno de nuestros pacientes a analizar (o lo que es lo mismo, una representación del genoma de cada uno de ellos), el siguiente paso es aumentar en número de copias de nuestro gen problema en la muestra de ADN genómico de cada paciente. Hay que tener en cuenta que solo el 2( del genoma es INFORMACIÓN CODIFICANTE (secuencias de ADN que se transcriben a ARN mensajero y se traducen a PROTEINAS) el 98( restante se considera ADN BASURA. Además este 2( comprende aproximadamente 30.000 genes entre los cuales se encontrará nuestro gen problema. Así pues detectar nuestro gen problema en la muestra de ADN genómico es como buscar una aguja en un pajar, por esta razón la PCR es una técnica indispensable en el análisis genético.

La técnica de la PCR se basa en la preparación de una mezcla con una serie de compuestos a la que se somete a distintas temperaturas (o etapas). Esta mezcla consta de:

1. ADN molde (en nuestro caso ADN genómico).
2. Dos pequeñas moléculas de ADN de cadena sencilla correspondientes a los dos extremos de la secuencia de ADN que queremos amplificar mediante PCR (en nuestro caso esta secuencia será la zona de nuestro gen problema en la que está localizado en polimorfismo que queremos analizar). A estas pequeñas moléculas de ADN se les denomina OLIGONUCLEÓTIDOS.
3. Los nucleótidos o dNTPs
4. La enzima ADN polimerasa que es la encargada de introducir los dNTPs complementarios a la cadena molde.

El primer paso de la PCR consiste en la DESNATURALIZACIÓN del ADN molde de doble cadena en sus dos cadenas sencillas, este paso tiene lugar a temperaturas de 94ºC. El siguiente paso es el ANILLAMIENTO de los OLIGONUCLEÓTIDOS en ambos extremos de la región a amplificar, esta etapa se realiza a temperaturas que pueden variar entre 50 y 60ºC (según las características de los oligonucleótidos). La etapa final se denomina EXTENSIÓN y consiste en la acción de la enzima ADN POLIMERASA  que se encarga de añadir a la cadena en formación los nucleótidos complementarios a la cadena molde hasta originar una cadena complementaria completa, esta etapa de extensión se suele realizar a 72ºC. El conjunto de estas tres etapas de DESNATURALIZACIÓN, ANILLAMIENTO y EXTENSIÓN constituye un CICLO, en una reacción de PCR se suelen realizar unos 40 ciclos en cada uno de los cuales aumenta exponencialmente el número de copias de nuestro gen problema, pasando de una o unas pocas copias a millones de copias en un tiempo aproximado de tres horas. La PCR se realiza en unos aparatos denominados TERMOCICLADORES en los que introducimos las muestras y programamos las condiciones de nuestra reacción de PCR. Ejemplo: 40 ciclos de (desnaturalización a 94ºC, anillamiento a 57ºC y extensión a 72ºC)

- Determinación de la presencia del polimorfismo en cada paciente, mediante SECUENCIACIÓN / UTILIZACIÓN DE ENZIMAS DE RESTRICCIÓN, ETC.

Una vez que tenemos un número adecuado de moléculas de nuestro gen problema podemos proceder a su análisis en busca del polimorfismos objeto de estudio. Este análisis puede abordarse mediante distintas técnicas, la más directa de todas ellas es la SECUENCIACIÓN. Hoy en día en la mayoría de centros de investigación se dispone de un SERVICIO DE SECUENCIACIÓN AUTOMÁTICA DE ADN. A este servicio llevamos las muestras resultantes de la PCR de cada uno de los pacientes analizados, el técnico responsable se encarga de realizar la reacción de secuenciación y nos manda la información resultante en forma de CROMATOGRAMA. El cromatograma es un diagrama en el que cada uno de los cuatro posibles nucleótidos está representado con un color distinto (la A en verde, la G en negro, la C en azul y la T en rojo), los puntos en los que aparezca una variación en la secuencia (polimorfismo) se detectarán por un cambio de color en el pico del cromatograma.

Otro método de análisis es el empleo de ENZIMAS DE RESTRICCIÓN. Estas enzimas son proteínas capaces de reconocer determinadas secuencias en el ADN de doble cadena e introducir un corte en este punto. La ocurrencia de un polimorfismo puede dar lugar a la aparición o desaparición de una de estas secuencias de corte que son reconocidas por las enzimas de restricción, lo cual supone, que cuando sometemos nuestro producto de PCR al corte con estas enzimas nos dará un tamaño de banda distinto en función de que el polimorfismo esté o no presente. Estos cambios en el tamaño de los fragmentos de ADN pueden ser detectados en un gel de ELECTROFORESIS.

- Realización de un ESTUDIO ESTADÍSTICO en búsqueda de asociaciones polimorfismo-enfermedad.

Las posibles diferencias en la frecuencia de aparición del polimorfismo entre los distintos grupos de pacientes analizados han de confirmarse mediante métodos estadísticos que determinen la significación o no de las asociaciones observadas. Frecuentemente, observamos problemas de reproducibilidad en estos estudios de asociación polimorfismo-enfermedad entre las distintas poblaciones analizadas. Estas diferencias pueden explicarse, bien por variaciones genéticas entre razas o también por fallos en el diseño del experimento o en la forma de interpretar los datos. Por esta razón, es conveniente utilizar algún método que corrobore nuestros datos estadísticos, como el cálculo del PODER ESTADÍSTICO (Fleiss JL. Statistical Methods for Rates and Proportions. In: John Wiley and Sons.New York, 1981) y la PROBABILIDAD DE FALSOS POSITIVOS o FPRP.

(Wacholder et al., Assessing the probability that a positive report is false: an approach for molecular epidemiology studies. J Natl Cancer Inst 2004, 96(6):434-442).

Otra situación posible es que queramos BUSCAR NUEVOS POLIMORFISMOS (no descritos previamente) EN NUESTRO GEN CANDIDATO. Para este fin existen diversas técnicas moleculares la mayoría de las cuales se basan en una misma propiedad del ADN. Esta propiedad consiste en que un cambio en un único nucleótido de una secuencia de ADN da lugar a "fallos" en el plegamiento del ADN que originan cambios a la hora de migrar en un gen de ELECTROFORESIS o a la hora de ser detectados en un ANÁLISIS CROMATOGRÁFICO. Algunas de las técnicas que utilizan este principio en la detección de polimorfismos son : SSCP, DSCA o DHPLC.

Otras posibilidades para abordar la búsqueda de nuevos polimorfismos son el empleo de PCR CUANTITATIVA (o PCR a tiempo real), ARRAYS, PIROSECUENCIACIÓN, ESPECTROMETRIA DE MASAS, etc.

Un segundo paso en el estudio de polimorfismos es la BÚSQUEDA DE UNA EXPLICACIÓN FUNCIONAL a las diferencias significativas detectadas. Por ejemplo, si hemos detectado que la presencia de un polimorfismo en la región promotora de un gen es mucho más frecuente (estadísticamente significativo) en una población de pacientes alérgicos que en una población de controles sin alergia, y por lo tanto hemos concluido que existe una asociación entre la presencia del polimorfismo y la alergia, de lo que se trata ahora es de estudiar los mecanismos moleculares mediante los cuales el cambio de un único nucleótido determina los pacientes tengan un mayor probabilidad de padecer alergia. Para llevar a cabo este estudio funcional vamos a analizar la expresión de nuestro gen. Este análisis de expresión puede realizarse mediante distintas técnicas. Podemos ANALIZAR LA EXPRESIÓN EN UN MODELO CELULAR, transfectando células con una construcción que esté compuesta por un gen "chivato" (gen cuya expresión es fácilmente cuantificable, por ejemplo por producir una señal luminosa) bajo el control de la región promotora problema (en la que se localiza el polimorfismo). Si tenemos una construcción con el promotor sin alteración alguna y una segunda construcción con la misma región promotora en la que está presente el polimorfismo, podremos cuantificar la eficiencia del promotor mediante el nivel de expresión del gen chivato (o lo que es lo mismo, mediante la cantidad de luz producida). Así, podremos concluir que la presencia del polimorfismo determina un aumento o una disminución de la expresión génica.

Otra forma de analizar la expresión es mediante la técnica de NORTHERN que consiste en la hibridación de la población global de todos los ARN mensajeros correspondientes a todos los genes que se están transcribiendo, con una molécula marcada (sonda) que es complementaria al gen problema cuya expresión queremos cuantificar. El hecho de que la población de ARNs mensajeros y la sonda estén en cadena sencilla permite que a la temperatura adecuada, se produzca una reasociación del ambas moléculas complementarias, que servirá para detectar la expresión de nuestro gen problema.

Otras técnicas aplicadas en análisis de expresión son la RT-PCR que se basa en la capacidad de una enzima llamada transcriptasa reversa de copiar los ARN mensajeros en sus correspondientes ADN copia (cDNA) o la PCR CUANTITATIVA en la que por cada ciclo de amplificación de la PCR se produce una señal luminosa, cuanto mayor sea el número de moléculas de cDNA presentes en la muestra original (o lo que es lo mismo, cuanto mayor sea la expresión de nuestro gen en la muestra original) más señal luminosa detectaremos.

Finalmente los MICROARRAYS o MICROMATRICES consisten en una matriz sólida con varios pocillos, en cada uno de los cuales hay una sonda para medir la expresión de un gen distinto. Estas matrices se hibridan con una muestra de cDNA de un paciente, de tal manera que la señal obtenida en cada pocillo representa el nivel de expresión de un determinado gen. Comparando la intensidad obtenida para un pocillo determinado, en una muestra de un individuo alérgico, con la intensidad obtenida en el mismo pocillo de otro microarray hibridado con cDNA de un individuo sano, podremos evaluar la expresión de ese gen en ambas muestras y concluir si hay un aumento, disminución o si la expresión se mantiene igual en ambas.

Una vez que hemos comprobado que nuestro polimorfismo da lugar a un cambio en la eficiencia de la región promotora en la que está localizado, podemos intentar determinar como ocurre este cambio de eficiencia mediante la realización de EXPERIMENTOS DE RETARDO EN GEL. Normalmente, la eficiencia de un promotor viene determinada por su capacidad para unir determinadas proteínas reguladoras que actúan activando o reprimiendo la expresión del gen controlado por este promotor. Mediante los experimento de retardo en gel comprobamos la ocurrencia de estas interacciones promotor-proteína reguladora. Estos experimentos consisten en preparar una reacción con extractos totales de proteínas nucleares (posibles proteínas reguladoras) y con un fragmento de la región promotora marcado radiactivamente. Si la región promotora no ha sufrido alteración, las proteínas reguladoras se unirán correctamente al promotor y detectaremos un complejo de retardo de gran tamaño en la electroforesis. Por el contrario, si la región promotora está alterada (por la presencia del polimorfismo) puede que las proteínas reguladoras no se puedan unir correctamente, por lo que no se formaran complejos de unión promotor-proteína y detectaremos únicamente el fragmento de la región promotora libre, cuyo tamaño es mucho menor que el del complejo promotor-proteína.