La alfalfa (Medicago sativa) es una planta leguminosa plurianual, que desempeña un papel importante de cara a la obtención de proteína vegetal para su utilización en las raciones alimenticias de los animales rumiantes.
Existen 55 géneros de leguminosas en nuestro área y gran número de especies. Solo del género Medicago sativa existen unas 27 especies, de aspecto muy parecido, en nuestro territorio.
Las leguminosas han sido descritas como causa de múltiples patologías alérgicas, que excede ver en detalle en este estudio, como: alergia alimentaria (cacahuete, legumbres, lupino...), asma por inhalación de sus harinas o su manipulación (soja, almorta, guisante, judía verde, algarroba...) e incluso de sus maderas (acacia, tali, jatoba...).
Se han descrito tests cutáneos positivos a polen de alfalfa en varios estudios epidemiológicos realizados en pacientes alérgicos en Francia, Oriente Medio y en España concretamente en Valladolid por la Dra. Armentia.
Sin embargo, a pesar de la amplia extensión de su cultivo, no se ha descrito la alfalfa como causa de rinoconjuntivitis o asma.
La exposición a la alfalfa se produce sobre todo de forma profesional durante su cultivo y procesado, pero también al inhalar partículas de alfalfa en las cercanías de las desecadoras de alfalfa.
El cultivo y procesado de la alfalfa se puede resumir de forma general en las siguientes etapas:
- Siembra: se realiza en otoño (si es de ciclo largo) o en primavera (si es de ciclo corto).
- Siega: comienza en abril, el espaciado entre los cortes oscila entre los 30-35 días. De este modo, la campaña de alfalfa genera estre 5-6 cortes anuales en las zonas de regadío.
- Secado y rastrillado: el secado se realiza en el campo durante unos 3-5 días. El rastrillado se realiza para disminuir el periodo de secado de la alfalfa en el campo y preparar los cordones definitivos para su posterior recogida con carros picadores o con picadoras.
- Recogida del campo y almacenamiento: el almacenamiento se realiza como alfalfa en rama o como alfalfa deshidratada, habitualmente en pacas. La ventaja de la alfalfa deshidratada es su homogeneidad y calidad uniforme a lo largo de todo el año.
- Utilización por el ganadero.
CASOS CLINICOS
Presentamos 6 pacientes que presentaban rinoconjuntivitis y asma cuando se exponían a alfalfa.
SPL (caso 1)
Varón de 20 años de edad con antecedentes personales (AP) de urticaria-angioedema por avellana y castaña, síndrome de alergia oral (SAO) por rosáceas y liliáceas y tests cutáneos positivos a pólenes de artemisia y plantago sin repercusión clínica actual. Es estudiante de ingeniería agrícola y refiere síntomas de rinoconjuntivitis y asma al estar en contacto con alfalfa en las prácticas en sus estudios.
JCR (caso 2)
Varón de 25 años. AP: polínico (olivo, chenopodium y plátano de sombra), hipersensibilidad a harina de cereales y SAO por cacahuete y pipas de girasol. Vive en un pueblo en una casa con molino y ayuda a su padre en el molino donde muelen a diario trigo, cebada, maíz, alfalfa y soja. Refiere rinoconjuntivitis y asma sobre todo con alfalfa y maíz.
RPA (caso 3)
Varón de 24 años. AP: rinoconjuntivitis y asma por alternaria y tests cutáneos positivos a polen de artemisia. Antecedentes familiares (AF): padre, madre y hermana asma alérgica. Vive en pueblo donde hay una desecadora de alfalfa y refiere síntomas de rinoconjuntivitis y asma con la alfalfa.
AOM (caso 4)
Varón de 32 años. AP: tests cutáneos positivos a polen de plantago y harina de maíz sin repercusión clínica actual. Trabaja en cooperativa agrícola y una de sus tareas es la carga y descarga de alfalfa. Esta actividad le produce síntomas de rinoconjuntivitis y asma.
ELF (caso 5)
Varón de 27 años. AP: rinoconjuntivitis-asma por tomate, pimiento y judía verde y urticaria-angioedema por harinas de cereales. AF: madre asmática. Vive en pueblo y ha trabajado de forma temporal en conserveras de verduras, camionero de cereales y actualmente en metalurgia frente a desecadora de alfalfa. Refiere rinoconjuntivitis y asma al exponerse a la alfalfa.
JGJ (caso 6)
Varón de 30 años. AP: rinoconjuntivitis severa y asma leve polínica por polen de gramíneas y chenopodium. AF: hermano rinoconjuntivitis por epitelio de gato. Vive en Zaragoza y trabaja como mecánico de maquinaria agrícola. Refiere rinoconjuntivitis y asma con la exposición a polvo de alfalfa que queda en la maquinaria que repara si ha trabajado con alfalfa.
MATERIAL Y METODOS
Extracto propio de alfalfa.
Para realizar el extracto de alfalfa partimos de 56 gramos de alfalfa desecada que mezclamos con 250 cc de agua destilada (22,4 gr de alfalfa por 100 ml). Se agitó en magnetoagitador 24 horas y se filtró. Se dializó durante 48 horas, cambiando el agua de la diálisis cada 24 horas. Lo esterilizamos a través de filtros millipore de 0,45 micras. Determinamos el contenido de proteínas por el método de lowry con resultado 2,5 mg/ml. Lo liofilizamos en viales partiendo de un volumen inicial de 2 ml para cada vial. Para realizar los estudios se reconstituye cada vial con 2 ml.
Tests cutáneos (TC) en prick.
- Se realizaron TC con batería de aeroalergenos estándar, harinas de cereales, ácaros de almacenamiento y leguminosas.
- TC con alimentos y otros alergenos según la clínica del paciente.
- TC con el extracto propio de alfalfa y prick by prick con hoja fresca de alfalfa (el prick by prick se realizó a los pacientes 3 y 5).
Control espirométrico.
Provocación bronquial específica con extracto de alfalfa.
Se realizó en los 6 pacientes.
Se realizó según la técnica de Hyman Chai con las siguientes modificaciones reflejadas en trabajos previos:
- El sistema generador de partículas era un De Vilbis 646.- El patrón respiratorio del paciente durante la inhalación con el extracto de alfalfa fue continuo a volumen corriente.
Para la realización de la prueba se siguieron las normas y recomendaciones dictadas por los grupos internacionales.
Los parámetros pulmonares escogidos para valorar la respuesta bronquial fueron:
- FEV1 (volumen espiratorio forzado en el primer segundo).- FEM (flujo espiratorio máximo).
La función pulmonar se monitorizó mediante espirometrías seriadas durante la realización de la provocación bronquial. Para el reconocimiento de las posibles respuestas tardías, durante las 24 horas siguientes a la provocación utilizamos un control del FEM cada hora, respetando el descanso nocturno, que el paciente realizaba en su domicilio.
Se consideró una respuesta bronquial positiva una disminución del FEV1 mayor o igual al 20% en la primera hora respecto al valor postsalino de ese mismo día (respuesta inmediata), una caída del FEM mayor o igual al 15% del valor postsalino en el posterior control horario durante las 24 horas (respuesta tardía), o ambas (respuesta dual).
Protocolo de la prueba
Inicialmente se realiza espirometría en condiciones basales, exigiéndose un FEV1 mayor o igual al 80% de su FEV1 teórico y mayor de 1500 cc. Se realizan diluciones a 1/2 a partir del extracto madre de alfalfa y se procede a realizar la titulación punto final en prick con todas las diluciones. Tras leer las pruebas cutáneas a los 15 minutos, seleccionamos la concentración del alergeno por la que empezaremos la provocación bronquial, como la previa a aquella con la que se ha obtenido una pápula de 3 mm de diámetro. Procedemos a iniciar la provocación bronquial haciendo inhalar durante 2 minutos solución salina 0,9%, realizándose espirometrías a los 5, 10 y 15 minutos tras finalizar la inhalación, en las cuales el descenso del FEV1 debía ser menor del 10% del FEV1 basal. El valor más bajo obtenido tras la inhalación del salino se consideró el valor control para expresar los posteriores porcentajes de descenso de FEV1. En ese momento realizamos una determinación del FEM con el mismo aparato portatil (Mini-Wright) que posteriormente daremos al enfermo para realizar las lecturas en su domicilio. Este valor de FEM es el que se consideró para expresar los posteriores porcentajes de descenso del FEM. Comenzamos la inhalación de la primera concentración de extracto de alfalfa realizándose control espirométrico en los mismos tiempos que el salino (5, 10 y 15 minutos). Administramos sucesivamente, en orden ascendente, las distintas concentraciones de alfalfa hasta obtener un descenso del FEV1 igual o mayor al 20%. Tras obtener una caída del FEV1 significativa (>20%) repetimos la espirometría a los 20, 30 y 60 minutos. Cuando tras la inhalación del antígeno el descenso del FEV1 esté entre el 15 y el 20% repetimos las espirometrías cada 5 minutos hasta que el descenso sea mayor del 20% o menor del 15%. Una vez registrados valores inferiores al 15% se administra la siguiente concentración, y si cae el 20% o más la prueba se considera positiva. Una vez recuperado el paciente, se le despide entregándole el medidor portátil de FEM con instrucciones de medirlo cada hora hasta que se acueste y a la primera hora de la mañana del día siguiente. Se le da una hoja de instrucciones para el tratamiento y actitud ante posibles reacciones tardías. El enfermo se citaba al día siguiente en la consulta para realizar una espirometría basal.
Los resultados se expresaron como PD20-FEV1-antigeno, que se define
como la concentración de antígeno que teóricamente produciría un
descenso del FEV1 del 20% sobre el valor basal. Para su cálculo
utilizamos la fórmula lineal propuesta por Cockcroft.
PD20= [(20-R1) (C2-C1) / (R2-R1) +
C1
C2= concentración de antígeno que produjo un descenso mayor del 20%.
R1= el % de disminución del FEV1 conseguido con C1.
R2= el % de disminución del FEV1 conseguido con C2.
Estudio inmunológico.
Se realizó en los cinco primeros pacientes. Del paciente 6 no disponíamos de suero.
El extracto liofilizado de alfalfa se resuspendió con 2 ml de tampón fosfato (2,5 mg/ml) y se guardó en alicuotas a -20ºC hasta su uso.
Valoración IgE específica
Para la valoración de profilina y Pru p 3 se utilizó el ensayo de IgE específica de la plataforma ADVIA-Centaur. Este ensayo utiliza una arquitectura tipo sandwich inversa, con un mAb anti-IgE humana, acoplado a partículas paramagnéticas, que captura toda la IgE presente en la muestra de suero. La separación magnética de las partículas permite el cambio de reactivos y los procesos de lavado. La IgE específica presente en las partículas reacciona con el alergeno marcado con biotina en medio liquido, y este se detecta con estreptavidina marcada con un ester de acridinio, que es un compuesto quimioluminiscente. La luz emitida se mide mediante un luminómetro, y existe una relación lineal entre la cantidad de luz emitida y la cantidad de complejo IgE-alergeno-estreptavidina presente. El sistema está calibrado en kU/l mediante una curva patrón que utiliza el alergeno Bet v 1 recombinante.
La valoración de IgE al alergeno de la cáscara de soja Gly m 1 se realizó por ELISA, utilizando en la fase sólida un mAb anti-Gly m1 como anticuerpo presentador del antígeno.
Inmunodetección
El extracto de alfalfa (150 µl por pocillo) y los marcadores de peso molecular se analizaron mediante SDS-PAGE (conc. acrilamida 15 %) en condiciones no reductoras. Las proteínas del gel de poliacrilamida se transfirieron electroforéticamente a tiras de papel NC (Towbin et al. Proc Natl Acad Sci USA 1979,76,4350-4). Finalizada la transferencia, las tiras de NC se saturaron con 1% BSA en PBS durante 1 h a tª ambiente y, posteriormente, se incubaron durante ~18 h con el suero de los pacientes diluido 1/5 y, como control negativo, una tira de NC se incubó con 1% BSA en PBS . Después de lavar las tiras con 0,1% Tween-20 en PBS, estas se incubaron, durante 2 h a tª ambiente, con ascitis del mAb anti-IgE humana HE-2 diluido 1/3000 (Sánchez-Madrid et al. J. Immunol Methods 1984, 73, 367-378). Finalmente, se lavaron las tiras y las proteínas con capacidad de fijar IgE se detectaron mediante quimioluminiscencia (ECL, Amersham Bioscience) siguiendo las instrucciones del fabricante.
Paralelamente, una tira de NC se incubó con un anticuerpo policlonal de conejo anti-LTP de melocotón (Pru p 3) y posteriormente con un 2º anticuerpo anti-IgG de conejo marcado con peroxidasa, siguiéndose a continuación el mismo procedimiento que en el caso de la inmunodetección de IgE.
RESULTADOS
Todos los pacientes eran varones, debido a que son los hombres los que más se exponen a la alfalfa en nuestro medio pues todavía desempeñan de forma mayoritaria los trabajos agrícolas y ganaderos que los exponen a ella.
Tres de los pacientes (50%) tienen antecedentes familiares de atopia.
Los resultados de los tests cutáneos en prick se exponen en las tablas 1 y 2. Todos los pacientes presentan tests cutáneos positivos con el extracto de alfalfa. A los pacientes 3 y 5 se les realizó tests cutáneos prick by prick con hojas de alfalfa que fueron positivos. Todos los pacientes tenían otras sensibilizaciones: 3 alergia alimentaria y los 6 a otros aeroalergenos (5 polínicos: 2 chenopodium, 2 artemisia, 1 olivo, gramíneas y plátano de sombra; 1 alternaria y 3 harinas de cereales).
Los resultados de las provocaciones bronquiales específicas con extracto de alfalfa se exponen en las tablas 3 y 4. Todas fueron positivas: 5 presentaron reacciones inmediatas y el sexto dual. La respuesta dual en detalle se puede observar en las figuras 1 y 2, siendo especialmente intensa la respuesta tardía con una caída de más del 50% del FEV1.
Se realizaron controles con el extracto propio de alfalfa. Practicamos TC en prick en 20 pacientes polínicos y en otros 20 sensibilidados a hongos que resultaron negativos. También fueron negativas las provocaciones bronquiales específicas con alfalfa en 2 pacientes con asma persistente moderada, una alérgica y otra no alérgica.
La Tabla 5 muestra los resultados del análisis de IgE específica.
|
|
IgE, kU/l |
||||
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Alergeno |
SPL 1 |
JCM 2 |
RPA 3 |
AOM 4 |
ELF 5 |
|
Profilina |
0,09 |
0,06 |
0,04 |
0,49 |
0,05 |
|
Pru p 3 |
34,43 |
22,54 |
0,16 |
167,17 |
0,39 |
|
Gly m 1 |
ND |
ND |
ND |
ND |
ND |
La figura 3 muestra el resultado de la inmunodetección de IgE.
El paciente RPA no tiene IgE sérica contra proteínas de alfalfa. El resto de los pacientes tienen IgE contra diferentes bandas del extracto de alfalfa, principalmente bandas de aprox. 14, 22, 26, 50 y 75 kDa. La banda de 14 kDa podría tratarse de una LTP de alfalfa. A favor de esto está el p.m. del alergeno y el hecho de que todos los pacientes excepto RPA tienen IgE contra Pru p 3, no detectándose IgE contra profilina, que tiene un p.m. en el mismo rango. Sin embargo, la inmunodetección del extracto de alfalfa con un anticuerpo policlonal anti-LTP de melocotón dio negativa (datos no mostrados), si bien este resultado podría explicarse se existiera una baja reactividad cruzada entre la LTP de alfalfa y la de melocotón.
DISCUSION
La alfalfa tiene su área de origen en Asia Menor y el sur del Cáucaso y actualmente se trata de un cultivo muy extendido en países de clima templado. La importancia del cultivo de la alfalfa va desde su interés como fuente natural de proteínas, fibra, vitaminas y minerales (abastece la industria de piensos para la ganadería); así como su contribución paisajística y su utilidad como cultivo conservacionista de la fauna; además de la importante reducción energética que supone la fijación simbiótica del nitrógeno para el propio cultivo y para los siguientes en las rotaciones de las que forma parte.
En España es la planta forrajera con mayor extensión de cultivo. La superficie de cultivo de alfalfa en los países mediterráneos la vemos en la tabla 6. En España la comunidad autónoma en que más alfalfa produce es Aragón, como se observa en la tabla 7.
A pesar de ser un cultivo extendido, llama la atención que no se haya descrito la alfalfa como causa de patología alérgica. Sí se ha descrito en varias ocasiones, en estudios epidemiológicos, tests cutáneos positivos a polen de alfalfa. Concretamente en España la Dra Armentia en 1991 publicó un estudio que encontraba una sensibilización a polen de alfalfa en el 78,75% de los polínicos en Valladolid. Previamente Peterson et al en 1986 lo había descrito y posteriormente encontramos trabajos como los de Bener el al en 2002 en Emiratos Arabes Unidos y el de Suliaman et al en 1997 en arabia Saudí que también encuentran un importante número de sensibilizaciones a polen de alfalfa en pacientes alérgicos.
Centrándonos de nuevo en nuestros pacientes, todos ellos referían de forma espontánea clínica de rinoconjuntivitis y asma cuando se exponían a la alfalfa. En todos ellos la exposición a ella era intensa. Demostramos en los 6 sensibilización con tests cutáneos en prick positivos a la alfalfa, confirmando la alfalfa como causa de su asma por la provocación bronquial específica. Además ratificó el diagnóstico que al evitar la exposición a la alfalfa (que no fue difícil, salvo en el caso del trabajador en cooperativa agrícola, que dejó de exponerse por estar de baja por accidente laboral) la clínica desaparecía.
No encontramos asociación entre la sensibilización a alfalfa y otras sensibilizaciones, tanto a alimentos como otros aeroalergenos. Las otras sensibilizaciones dependerían de la exposición de los pacientes a esos alergenos (los 3 pacientes con hipersensibilidad a harinas de cereales) o serían sensibilizaciones que en nuestro ambiente podrían presentar 6 pacientes atópicos.
Detectamos IgE específica contra el extracto de alfalfa en 4 de los 5 pacientes, presentando el extracto bandas que fijan IgE de 14, 22, 26, 50 y 75 kDa. No detectamos IgE contra profilina ni Gly m 1, pero sí contra Pru p 3 a niveles altos en 3 de los 5 pacientes, aunque no detectamos positividad con anticuerpo policlonal anti-LPT de melocotón en el extracto de alfalfa. Estamos profundizando en el estudio inmunológico y no descartamos que la responsable de esta sensibilización a alfalfa sea una LPT, como se ha visto en estudios con otros vegetales realizados recientemente.
CONCLUSIONES
- Describimos la alfalfa como agente causal de asma alérgico causado por mecanismo IgE mediado.
- Los tests cutáneos en prick y los estudios inmunológicos lo demuestran y se confirma con las pruebas de provocación bronquial específica.
- El estudio inmunológico ha identificado varios alergenos del extracto de alfalfa con pesos moleculares de aproximadamente 14, 22, 26, 50 y 75 kDa que fijan IgE se los pacientes.
- La alfalfa se debería testar en los pacientes con rinoconjuntivitis y/o asma en el medio agrícola.
BIBLIOGRAFIA RECOMENDADA
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