Los basófilos de sangre periférica y los mastocitos de tejidos son las células efectoras primarias de las reacciones inmediatas mediadas por IgE tales como rinitis, asma y anafilaxia, pero también se encuentran involucradas en otro tipo de reacciones alérgicas o pseudo-alérgicas, en las que se implican mecanismos de activación tales como la activación por complemento o reacciones no mediadas por IgE o mecanismos no inmunológicos (1).

Los basófilos representan en sangre periférica menos del 0,5% del total de leucocitos, hecho que dificulta su purificación. Dado que estas células juegan un papel importante en reacciones inmediatas alérgicas, se han desarrollado pruebas funcionales in vitro que detectan su activación; así, una de las primeras aproximaciones es el test de liberación de histamina, técnica controvertida debida a su insuficiente sensibilidad y especificidad (2). Por este motivo, varios grupos aprovecharon las ventajas de la citometría de flujo para desarrollar nuevas herramientas para monitorizar la activación de los basófilos tras estímulo antígeno-específico detectando la expresión de marcadores de superficie (3-4).

 

Principio del test de activación de basófilos

La citometría de flujo es una herramienta válida para el análisis de diferentes tipos celulares y puede ser utilizada para identificar poblaciones específicas de células, incluso aquellas que están presentes en bajas cantidades, y se ha demostrado que es útil en el estudio de la activación inducida por el alergeno. La base de estos ensayos es la demostración de ciertos fenotipos de membrana que aparecen tras la exposición al alergeno.

Así, se describe una regulación a la alta en la expresión de CD45 (5), CD11b, CD11c, regulación a la baja de CD62L (3), y disminución del número de basófilos IgE-positivos tras estímulo in vitro con el alergeno. Sin embargo, la mayoría de los artículos publicados hacen referencia a la expresión de CD63 sobre basófilos tras su activación in vitro (6-8) o a la expresión de CD203c (9).

Los basófilos son capaces de liberar el contenido de sus gránulos tras un proceso de activación dependiente del estímulo antigénico. La degranulación que ocurre tras el puenteo de receptores IgE por acción de un alergeno divalente provoca la fusión intracitoplasmática de los gránulos y la fusión de la membrana de estos con la membrana plasmática, con lo que moléculas presentes en la membrana de los gránulos, tales como la molécula CD 63, se expresarán en la membrana del basófilo, cuando éste se encuentre activado.

El CD63 es un tetraspano, proteína granular de 53 Kda que se expresa no sólo en los gránulos del basófilo y en la superficie de éste cuando se activa, sino también en monocitos, macrófagos y plaquetas. Esta proteína es el único marcador conocido que aparece en la superficie del basófilo cuando se activa. La expresión de este marcador se correlaciona con la degranulación, lo que hace que esta molécula sea un marcador ideal de activación del basófilo (10). En la técnica de estimulación in vitro con el alergeno, las células de sangre periférica son incubadas con el alergeno sospechoso durante un periodo de 15–40 minutos y a 37ºC. Tras parar la reacción, se procede a la tinción con anticuerpos marcados con fluorocromos: Anti-CD63-PE y anti-IgE-FITC. Se utilizan dos controles, el negativo, en el que las células se incuban con el buffer utilizado en el ensayo, que contiene IL3 (control negativo o estimulación basal) y como control positivo se puede utilizar una anti-IgE.

La evaluación de la positividad de los resultados se realiza en base a la estimación de los puntos de corte para cada alergeno, tras realización de curvas ROC.

La técnica ha sido considerada como válida para el diagnóstico alergológico in vitro (11), donde ha sido validada para diferentes alergenos: inhalantes (8,12,13), venenos de himenópteros (7,14), látex (15-17), relajantes musculares (18,19), antibióticos betalactámicos (20-22), pirazolonas (23,24), AINES (24,25).

Últimamente, se ha estudiado su rendimiento diagnóstico utilizando alergenos recombinantes (26) y se estudia el rendimiento de la técnica en la monitorización de la inmunoterapia Ag-específica (27) y en el diagnóstico de alergia alimentaria (6,28,29).

 

Desarrollo técnico del test de activación de basófilos

La técnica se realiza en varios pasos:

1- Extracción de la sangre venosa periférica y preparación de la suspensión celular.

2- Estimulación con el alergeno o alergenos sospechosos, incluyendo un control negativo y otro positivo.

3- Marcaje de las células con los anticuerpos fluorescentes que reconocen a los basófilos (anti-IgE) y otro anticuerpo que reconoce a los basófilos activados (CD63 o CD203c).

4- Contaje en el citómetro.

 

Utilización de sangre total o leucocitos aislados

La técnica puede realizarse tomando como sustrato la sangre total o bien células aisladas. La sangre total tiene la ventaja de simplificar la manipulación (menos pasos de centrifugación), pero tiene varias desventajas como son una menor recuperación de basófilos, la interferencia de componentes del suero (anticuerpos IgE e IgG) que puedan dar una disminución en la sensibilidad o componentes que provoquen una activación inespecífica en controles (30), la interferencia de agregados de plaquetas que también expresan marcadores CD63 y pueden ser las responsables de imprecisiones en el contaje del citómetro (3,31,32).

 

Factores que afectan al control negativo

Es importante obtener un control negativo tan bajo como sea posible, especialmente cuando se investigan alergenos que dan una baja estimulación específica, tales como los medicamentos. En líneas generales, el control negativo se sitúa por debajo del 5% en el 80% de los casos. La exposición natural al alergeno puede dar lugar a activación basal, por ejemplo en un individuo polínico que se estudie en época primaveral (33), aunque no todos los autores están de acuerdo con este hecho (13).

Lo mismo puede ocurrir cuando un paciente con alergia alimentaria ha tenido una reacción reciente (6) y en pacientes alérgicos a venenos en tratamiento inmunoterápico (27).

Existen varias causas posiblemente responsables de este hecho, en especial sustancias pirógenas o endotoxinas que pueden encontrarse como contaminantes en el agua utilizada en la técnica o en otros reactivos de uso, como la heparina, sustancias preservativas o incluso en los tubos o placas de plástico. En este sentido, es importante utilizar agua ultrapura, y material de plástico de grado de cultivo (34).

 

Factores que afectan al control positivo

La mayoría de los estudios utilizan anti-IgE mono o policlonal en el ensayo, pero se sabe que hay un porcentaje de pacientes que no reaccionan frente a la anti-IgE, tanto en liberación de histamina (3) como en producción de sulfidoleucotrienos (35,36). Este porcentaje de no reactores a anti-IgE varía según los autores entre 15-25 % (6,37,38).

Si el control positivo es negativo, un resultado negativo frente al antígeno puede ser un falso negativo, hecho a tener en cuenta en la interpretación de los resultados.

Este fenómeno parece ser más frecuente en los individuos no atópicos (8). No existe una correlación entre los niveles de IgE total y el grado de activación de basófilos por anti IgE (n=104; r=0.002; p=n.s, resultados no mostrados), hecho que refleja la ausencia de relación entre la reactividad de los basófilos y el nivel de IgE. Por otro lado, la sensibilidad del control positivo puede mejorar utilizando un anticuerpo monoclonal anti-receptor- IgE (FceR1) en lugar de anti-IgE, incrementando así el porcentaje de activación y el número de reactores (18).

 

Efecto del almacenaje de la sangre

La sangre extraída para la realización de pruebas celulares como esta, requiere algunas condiciones especiales para conseguir una buena viabilidad celular.

La recuperación de un número aceptable de basófilos, y en condiciones adecuadas, está sujeta al tiempo y temperatura de almacenaje de la muestra. Se sabe que la muestra guardada a 4ºC muestra una viabilidad adecuada a las 24 horas de su extracción. En condiciones normales y a temperatura ambiente, la reacción mediada por IgE disminuye gradualmente, debido probablemente a la deplección de IgE que sufren las células ex vivo (6,34). A las 48 horas de extraer la sangre y conservada a 4ºC, todavía se observa una buena respuesta, pero para sensibilidades más bajas, como ocurre con medicamentos, puede observarse un número mayor de falsos negativos (6).

 

Efecto del tiempo de incubación con el alergeno

La activación mediada por IgE es un proceso relativamente corto que alcanza su pico entre los 5-10 minutos, por lo cual la activación máxima de los basófilos puede esperarse en ese rango; no obstante, si la técnica se realiza en paralelo a la determinación de sulfidoleucotrienos en el sobrenadante, hay que considerar un tiempo de incubación superior (unos 40 minutos) para alcanzar su máxima producción (39).

 

Efecto de la concentración de alergeno

Es muy importante determinar la concentración óptima que provoca la máxima activación celular para cada alergeno, mediante la realización de curvas dosis-respuesta para cada uno de ellos. Si el rango de concentraciones que provocan estimulación Ag-específica es estrecho, será necesario utilizar varias concentraciones por alergeno a testar; si por el contrario, la activación para un alergeno determinado ocurre en un rango amplio de concentraciones, sin muchas variaciones, podremos utilizar una sola concentración.

En 40 minutos de incubación, hay tiempo suficiente para las interacciones celulares requeridas para que una respuesta celular tenga lugar. Para moléculas pequeñas tales como los medicamentos, el rango de concentraciones a los que la célula responde suele ser estrecho, así por ejemplo: 0.001 – 0.0001 mM/L para miorrelajantes (18). De todas formas, se recomienda la utilización de al menos dos concentraciones seriadas.

Es esencial utilizar alergenos o medicamentos libres de agentes preservativos, tales como el glicerol, agentes pirógenos, y sustancias que puedan provocar una activación inespecífica. Para cada medicamento nuevo a ensayar se hace necesaria la realización de los adecuados controles sanos y la realización de curvas ROC para analizar adecuadamente los puntos de corte.

 

Reproducibilidad

La reproducibilidad intraensayo realizada mediante determinaciones duplicadas para los diferentes alergenos es alta, lo que permite la realización de un único test por cada concentración de alergeno.

 

Evaluación de resultados

Para una apropiada evaluación de los resultados hay que considerar dos valores:

a) El número absoluto de basófilos evaluados, que nos da idea de un número suficiente de basófilos que debe ser superior a 150. Algunos autores describen la disminución de la fluorescencia emitida por las células activadas por el alergeno in vitro (14,18,40), lo cual parece no afectar al porcentaje de basófilos que expresan CD63 tras dicho proceso de activación.

b) El porcentaje de basófilos activados. En el control negativo (sin estímulo), el porcentaje de basófilos activados se encuentra normalmente por debajo del 5%.

 

Criterios de positividad del TAB

Para establecer los puntos de corte para cada alergeno, se hace necesaria la aplicación de curvas ROC. Es importante tener en cuenta, además, las siguientes consideraciones:

- El control negativo puede mostrar valores variables, aunque lo más frecuente es que sea <5%.

- Algunos alergenos, en especial los alimentos, pueden provocar estimulaciones inespecíficas.

- Otros, tales como los medicamentos, ofrecen una respuesta más baja, dependiendo del enfermo, pero casi siempre inferior a la observada por inhalantes.

Como regla general, los puntos de corte que ofrecen los valores más altos de especificidad y sensibilidad determinados por curvas ROC (21,24). son los siguientes: Para alergenos inhalantes >15 %; alergenos alimentarios >15%; látex >10%; venenos de himenópteros >10%; *Betalactámicos> 5 % e IE> 2; *Metamizol >5 % e IE >5; *Aspirina > 5% e IE> 2. *IE:Índice de estimulación= estimulación por el alergeno/estimulación basal o control neg

Algunos autores encuentran una correlación entre el grado de sensibilización clínica y el porcentaje de basófilos activados (30) pero otros no confirman este hecho (6). Para los relajantes musculares, parece existir una correlación entre el grado de sensibilidad cutánea y la expresión de CD63 (18).

 

Comparación con otras técnicas de diagnóstico in vitro

Se han realizado comparaciones para varios alergenos y el TAB muestra una buena correlación con la determinación de histamina y/o los sulfidoleucotrienos (CAST) (6,8,21,41), pero el TAB parece ser más sensible y específico que las otras técnicas (42).

Para el diagnóstico de reacciones inmediatas frente a betalactámicos, la utilización conjunta de TAB y CAST ofrece mejores resultados, llegando a detectar hasta el 80% de los casos. Lo mismo ocurre con las pirazolonas (42).

 

Indicaciones clínicas y resultados

Las indicaciones mayores del TAB son las siguientes:

1- Alergia a inhalantes, especialmente en aquellos casos en los que las pruebas cutáneas no pueden realizarse por razones diversas (reacciones cutáneas, niños...), o en casos en los que se encuentran discrepancias entre las pruebas cutáneas y la historia clínica. La sensibilidad para inhalantes es del 93% y la especificidad del 98.4 % (8). En casos como la polinosis por polen de ciprés, esta técnica es muy sensible y específica (12).

2- En alergia alimentaria esta técnica es útil y alcanza una sensibilidad del 80-82% (6,29). La utilización de alergenos recombinantes en el futuro mejorará los resultados de la técnica.

3- En alergia al látex, esta técnica es muy sensible y específica, incluso más fiable que la prueba cutánea (15-17).

4- En alergia a venenos de himenópteros es también altamente sensible y específica (14,27,42,43), incluyendo algunos venenos más raros como el de mosquito (44).

5- Alergia e intolerancia a medicamentos: Esta técnica ofrece información útil en reacciones inmediatas mediadas por IgE, tales como la alergia a betalactámicos (20-22), relajantes musculares (18,19), analgésicos (24). Permite, además, confirmar el diagnóstico para medicamentos para los que no existe otra técnica in vitro (45), así como detectar reacciones de hipersensibilidad a analgésicos antiinflamatorios no esteroideos, en los que intervienen mecanismos no mediados por IgE (24,25), o reacciones frente a expansores del plasma o inmunoglobulinas (45).

Aunque la sensibilidad de esta técnica en estos casos no es muy alta, la especificidad es muy buena (18). Todo ello permite en aquellos casos positivos obviar en ocasiones la prueba de exposición. También el TAB ha resultado de utilidad en la detección de anticuerpos anti-IgE o anti-IgE receptor en urticaria crónica (46,47.

 

Ventajas del test de activación de basófilos

• Es una técnica que reproduce in vitro los mecanismos de hipersensibilidad celular implicados en una reacción alérgica de tipo inmediato.

• Permite el diagnóstico de reacciones alérgicas y pseudoalérgicas especialmente para medicamentos, que no son detectables mediante técnicas serológicas, tales como la determinación de IgE específica.

• Los resultados se obtienen en unas pocas horas.

• Se pueden testar en paralelo varios alergenos con una cantidad de sangre pequeña.

• La sangre puede extraerse hasta 24 horas antes de la realización de la técnica, lo que permite el envío de muestras a laboratorios especializados.

• Evita, en muchos casos, la realización de la prueba de exposición al alergeno.

Todo ello aconseja su utilización en la rutina diagnóstica alergológica.

 

Aplicación del TAB al estudio de la mastocitosis y alergia

La relación entre mastocitosis y alergia es un tema poco estudiado No se conoce en la actualidad la prevalencia de alergia en enfermos con mastocitosis. Parece que los niveles de Ac IgE específicos son inferiores a los pacientes alérgicos sin mastocitosis y que los pacientes con mastocitosis y alergia presentan un riesgo mayor de anafilaxia.

No ha sido posible establecer la relación entre presencia de IgE esp y la clínica de estos pacientes.

Parece que los mecanismos de activación de los mastocitos no son iguales a los alérgicos, además no está claro el papel de la unión IgE-Anti IgE en mastocitosis.

Estudiamos el modelo de comportamiento del basófilo en pacientes con mastocitosis y alergia en un grupo de 15 pacientes con mastocitosis y alergia, 10 pacientes con Alergia sin mastocitosis y 2 pacientes con mastocitosis sin alergia, frente a los alergenos que figuran en la tabla 1.

 

En todos ellos se estudió la IgE total y específica mediante CAP Phadia y el test de activación de basófilos frente a varias concentraciones de los alergenos señalados mas arriba.

En cuanto a los resultados obtenidos el TAB fue positivo en 7 de los 15 pacientes con mastocitosis y alergia, con respuesta a anti-IgE positiva en 12 de ellos, en el grupo de pacientes con alergia sin mastocitosis fue positivo el TAB en 9 de 10 , con respuesta positiva a anti IgE positiva en todos ellos y en el grupo de mastocitosis sin alergia los dos pacientes fueron negativos a todos los alergenos ensayados, con respuesta positiva a la anti IgE.

Estos resultados preliminares nos llevan a las siguientes conclusiones:

• Los pacientes con mastocitosis y alergia presentan un patrón de respuesta en TAB similar a los pacientes con alergia sin mastocitosis.

• Los pacientes con mastocitosis y alergia presentan niveles de IgE específica positivos frente a los alergenos implicados.

• Los pacientes con mastocitosis sin alergia muestran una respuesta negativa en TAB a los alergenos convencionales, de manera que el TAB presenta una buena especificidad para el estudio de estos pacientes con mastocitosis

 

Referencias

1. Schleimer R.P., Fox C.C., Togias A., Norman P., Lichtenstein L.M. Role of human basophils and mast cells in the pathogenesis of allergic diseases J.Allergy Clin. Immunol., 1985; 76, 369-374.

2. Robert G.H, Adkinson N. F. Clinical laboratory assessment of IgE-dependent hypersensitivity J Allergy Clin Immunol. 2003 Feb;111 (2 Suppl): S687-701.

3. Sainte-Laudy J, Sabbah A, Vallon C, Guerin JC. Analysis of anti-IgE and allergen induced human basophil activation by flow Cytometry. Comparison with histamine release. Inflam Res 1998,47:401-8.

4. Monneret G, Gutowski MC, Bienvenu J: Detection of allergen-induced basophil activation by expression of CD63 antigen using flow cytometric method. Cli Exp Immunol 1999;115:39.-6.

5. Gane P, Pecquet C, Lambin P, Abuaf N, Leynadier F. Flow cytometry evaluation of human basophils. Cytometry 1993;14:344-8

6. Moneret-Vautrin DA, Sainte Laudy J, Kanny J, Fremont S. Human basophil activation measured by CD 63 expresion and LTC4 release in IgE-mediated food allergy. Ann Allergy Asthma Immmunol. 1999; 82: 33-40.

7. Sainte Laudy J, Drouet M, Lauret MG, Loiry M, Sabbah A. Test d’activation des basophiles par cytometrie en flux dans l’allergie aux venins d´hyménoptères. Allergie & Immunologie 1999; 31:11-14

8. Sanz M L, Sánchez G, Vila L, Uasuf C, Chazot M, Diéguez I, Oehling A, de Weck AL. Ag-induced basophil activation: CD63 cell expression detected by flow cytometry in patients allergic to Dermatophagoides pteronyssinus and Lolium perenne. Clin Exp Allergy 2001;31:1-8.

9. Boumiza R, Debard AL, Monneret G. The basophil activation test by flow cytometry: recent developments in clinical studies, standardization and emerging perspectives. Clin Mol Allergy. 2005;3:3-9

10. Bochner BS. Systemic activation of basophils and eosinophils: markers and consequences. J Allergy Clin Immunol 2000;160:S292-302.

11. Ebo DG, Hagendorens MM, Brits CH, Scherwegh AJ, De Clerck LS, Stevens WJ. In vitro allergy diagnosis: should we follow the flow? Clin Exp Allergy. 2004 Mar;34(3):332-9.

12. Pâris-Köhler A, Demoly P, Persi L, Lebel B, Bousquet J, Arnoux B. In vitro diagnosis of cypress pollen allergy by using cytofluorometric analysis of basophils (Basotest). J Allergy Clin Immunol 2000,105:339-45.

13. Saporta M, Kamei S, Persi L, Bousquet J, Arnoux B. Basophil activation during pollen season in patients monosensitized to grass pollens. Allergy. 2001; 56: 442-5.

14. Sainte-laudy J, Sabbah A, Drouet M, Lauret MG, Loiri M. Diagnosis of venom allergy by flow cytometry. Correlation with clinical history, skin tests, specific IgE, histamine and leukotriene C4 release. Clin Exp Allergy. 2000 Aug; 30 (8):1166-71.

15. Sanz ML, Gamboa PM, Garcia-Aviles C, Vila L, Dieguez I, Antepara I, de Weck AL. Flow-cytometric cellular allergen stimulation test in latex allergy. Int Arch Allergy Immunol. 2003;130:33-9.

16. Sanz ML, García-Avilés MC, Gamboa PM, Maselli JP, Diéguez I, De Weck AL. The use of a Flowcytometric basophil activation test (FAST) for the in vitro diagnosis of latex allergy. JACI 2002; 109: (abstr 869)

17. Stevens W.J., Schuerwegh A.J., Ebo D.G., Bridts C.H., DeClerck L.S. Value of an in vitro basophil activation marker (CD63) compared to latex specific IgE, skin testing and lymphocyte transformation in latex allergy. J. Allergy clin. Immunol, 2000, 104:abstract s243.

18. Abuaf N., Rajoely B., Ghazouani E., Levy D.A. Pecquet C., Chabane H., Leynadier F. Validation of flow cytometry assay detecting in vitro basophil activation for the diagnosis of muscle relaxant allergy. J. Allergy Clin. Immunol. 1999; 104: 411-418.

19. Monneret G, Benoit Y, Debard AL, Gutowski MC, Topenot I, Bienvenu J. Monitoring of basophil activation using CD63 and CCR3 in allergy to muscle relaxant drugs. Clin Immunol.,2002; 102 :192-199

20. Torres MJ, Padial, Mayorga C, Fernandez T, Sanchez-Sebate E, Cornejo-Garcia JA, Antunez C, Blanca M. The diagnostic interpretation of basophil activation test in immediate allergic reactions to betalactams. Clin Exp Allergy. 2004 Nov;34(11):1768-75

21. Sanz M.L., Gamboa P.M., Uasuf C., Vila L., Garcia-Aviles C., Chazot M., De Weck A.L. Flow-cytometric basophil activation test by detection of CD63 expression in patients with immedate type reactions to Beta-lactam antibiotics. Clin. Exp. Allergy, 2002; 32:277-286.

22. Sanz M.L., De Weck A.L., Uasuf C., Gamboa P.M., Chazot M. Use of flow cytometry to assess basophil activation in patients allergic to betalactam antibiotics. Correlation between Flow cytometric Alergen Stimulation Test (FAST) and other in vivo and in vitro tests. Int. Arch. Allergy Immunol, 2001, 124: 307- 308.

23. Sabbah A., Sainte-Laudy J., Drouet M., Lauret M.G., Loiry M. Réactions anaphylactiques ou anaphylactoïdes au paracétamol. A propos de 3 cas. Allergie et Immunologie, 1997; 29: 60-62.

24. Sanz ML, Gamboa PM, De Weck AL. A new combined test with flowcytometric basophil activation and determination of sulfidoleukotrienes is useful for in vitro diagnosis of hypersensitivity to aspirin and other nonsteroidal anti-inflammatory drugs.Int Arch Allergy Immunol. 2005;136:58-72.

25. Gamboa PM, Sanz ML, Caballero MR, Urrutia I, Antépara I, Esparza R, De Weck The flow-cytometric determination of basophil activation induced by aspirin and other non-steroidal anti-inflammatory drugs (NSAIDs) is useful for in vitro diagnosis of the NSAID hypersensitivity syndrome. Clin Exp Allergy 2004; 34:1448-57.

26. Erdmann SM, Sachs, Schmith A, Merck HF, Scheiner O, Moll-Slodowy S, Sauer I, Kwiecien R, Maderegger B, Hoffmann-Sommergruber K. In vitro analysis of birch-pollen-associated food allergy by use of recombinant allergens in the basophil activation test. Int Arch Allergy Immunol. 2005;136:230-8.

27. Erdmann SM, Sachs B, Kwiecien R, Moll-Slodowy S, Sauer I, Merk HF. The basophil activation test in wasp venom allergy: sensitivity, specificity and monitoring specific immunotherapy. Allergy. 2004 Oct;59(10):1102-9

28. Ebo DG, Hagendorens MM, Bridts CH, Schuerwegh AJ, De Clerck LS, Stevens WJ. Flow cytometric analysis of in vitro activated basophils, specific IgE and skin tests in the diagnosis of pollen-associated food allergy. Cytometry B Clin Cytom. 2005 Mar; 64 (1): 28-33

29. Garcia-Aviles C., Sanchez-Lopez G., Sanz M.L. Uasuf C., Dieguez I., Chazot M., De Weck A.L. Flow cytometric Allergen Stimulation Test (FAST) in the in vitro diagnosis of food allergy. Allergy, 2000; 55 (Suppl.63): 128

30. Stevens S., Drouet M., Lauret M.G., Loiry M., Sabbah A. Basophil activation test using flow cytometry in Hymenoptera venom allergy. Allergie et Immunologie,1999; 31: 11-14.

31. Metzelaart M., Wijngaard P.L.J., Peters P.J., Sioxma J.J., Nieuwenhuist H.K.,Clevers H.C. CD63 antigen: a novel lysosome membrane glycoprotein, cloned by a screening procedure for intracellular antigens in eukaryotic cells. J. Biol. Chem. 1991;266:3239-3245.

32. Sainte-Laudy J. Application of flow cytometry to the analysis of activation of human basophils. Immunologic validation of the method. Allergie et Immunologie 1998; 30: 41-43.

33. Sabbah A., Drouet M., Sainte-Laudy J., Lauret M.G. Loiry M. Apport de la cytométrie en flux dans le diagnostic allergologique. Allergie Immunologie, 1995; 29:15-21.

34. de Weck AL, Sanz ML. Flow Cytometric Cellular Allergen Stimulation Test (FAST/FLOW-CAST). Technical and Clinical Evaluation of a New Diagnostic Test in Allergy and Pseudo-Allergy. ACI International 14/5: 204-215, 2002.

35. Crockard A.D., Ennis M. Laboratory-based allergy diagnosis: should we go with the flow? Clin. Exp. Allergy, 2001; 31: 975-977

36. De Weck A.L., Stadler B.M., Urwyler A., Wehner H.U., Bühlmann R.P. Cellular Allergen Stimulation Test (CAST) Allergy Clin. Immunol. News, 1993; 5: 9-14.

37. Sabbah A., Sainte-Laudy J. Flow cytometry applied to the analysis of lymphocyte and basophil activation. ACI International, 1996; 8:116-119.

38. Sainte Laudy J., Valon C., Guérin J.C. Analyse de l’expression membranaire du marqueur CD63 par activation du basophile humain. Application au diagnostic allergologique. Allergie et Immunologie, 1994; 26: 211-214.

39. De Weck A.L. Zellulärer Allergen Stimulierungstest (CAST). Eine Uebersicht und kritische Auswertung der klinischen Anwendung in der Allergiediagnose. Allergologie, 1997; 20, 487-502.

40. Gane P., Pecquet C., Crespeau H., Lambin P., Abuaf N., Leynadier F., Rouger P. Flow cytometric monitoring of allergen induced basophil activation. Cytometry, 1995; 19: 361-365.

41. Sainte-Laudy J., Le Provost A., André C., Vallon C. Comparison of four methods for human basophil activation measurement: alcian blue staining, histamine and LTC4 release and flow cytometry. In Proc. 16th EAACI Congress (Basomba A., Hernandez M.D., De Rojas F. Eds), 1995: 257-260.

42. De Weck A.L., Gamboa P.M , Sanz M L. Clinical evaliationon in vitro tests in diagnosis of immediate allergic reactions to Betalactam antibiotics. ACI International, 2002; 14/5,185-192

43. Sabbah A., Plassais R., Grenapin S., Drouet M., Lauret M.G., Loiry M., Sainte-Laudy J. Le test d’activation des basophiles par cytométrie en flux dans le diagnostic de l’allergie aux venins d’hyménoptères. Allergie et Immunologie, 1998; 2: 44-51.

44. Sabbah H., Sainte-Laudy J., Hassoun S., Drouet M., Lauret M.G., Loiry M.L. A propos de l’allergie aux moustiques et de l’utilisation des nouveaux paramètres immuno-biologiques. Allergie Immunologie, 1997; 29: 126-128

45. Ebo D.G., Piel G.C., Conraads V., Stevens W.J. IgE-mediated anaphylaxis after first intravenous infusion of cyclosporine. Ann. Allergy Astma Immunol, 2001;87:243-245

46. Wedi B, Novacovic V, Koerner M, Kapp A. Chronic urticaria serum induces histamine release, leukotriene production, and basophil CD63 surface expression-inhibitory effects of anti-inflammatory drugs. J Allergy Clin Immunol. 2000 Mar; 105(3): 552-60

47. Gyimesi E, Sipka S, Danko K, Kiss E, Hidvegi B, Gal M, Hunyadi J, Irinyi B, Szegedi A. Basophil CD63 expression assay on highly sensitized atopic donor leucocytes. A useful method in chronic autoimmune urticaria. Br J Dermatol 2004 Aug; 151 (2): 288-96