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Conferencia
Inaugural: | |
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Ignacio Moneo. |
Resumen: La Investigación en Alergología ha experimentado en las últimas décadas un enorme avance respecto a lo conseguido hasta entonces. La caracterización de un gran número de alergenos o la producción de los más relevantes en forma de proteínas recombinantes son sólo dos ejemplos de los logros conseguidos durante este período de tiempo. Como hitos en el desarrollo de la investigación en este campo cabe destacar el descubrimiento de la transferencia de la sensibilidad por Prausnitz y Küstner y el descubrimiento de la IgE como causante de la alergia. Al poder disponer de reactivos que podían medir la presencia de este anticuerpo se completa la posibilidad de avanzar en la caracterización de alergenos, el estudio de reacciones cruzadas, etc. Durante este proceso la Alergología ha utilizado recursos y conocimientos adquiridos en otras disciplinas como los métodos ELISA, de inmunodetección, producción de anticuerpos monoclonales, etc. Es de destacar la contribución de la Biología molecular y de la informática que han posibilitado la producción de alergenos recombinantes, que son reactivos insustituibles en el momento actual. Todo ello está haciendo realidad el desarrollo de métodos de microarray que se encuentran en un grado incipiente, pero que alcanzarán en el futuro proporciones impensables hace unos años. En su conjunto, todo este esfuerzo ha convertido a la Alergología en una
disciplina con un amplio desarrollo de investigación en un continuo
avance hacia la Investigación básica. La investigación en Alergología tiene ciertas peculiaridades en comparación con la investigación en otras ciencias.
A continuación
revisaremos brevemente los hallazgos más importantes que han conducido
al estado actual de la Alergología como especialidad médica. Aproximadamente 45 años después, dos grupos independientes describen la
existencia de una nueva inmunoglobulina que interviene en la alergia
(2,3). Este hecho representa un antes y un después en alergología,
porque, entre otras cosas, convierte a la especialidad en una ciencia
objetiva y facilita el despegue de la investigación in vitro. Con
rapidez se desarrollan métodos de laboratorio para poder cuantificar la
IgE total y específica, que, con pequeñas variantes, persisten hasta el
momento actual (4). Dada la baja concentración a la que se encuentra
esta inmunoglobulina, los primeros ensayos se desarrollan utilizando
radioinmunoensayo, método ultrasensible que había sido puesto a punto
para mediciones de parámetros que se encontraran a nivel de trazas. La existencia de métodos in vitro de cuantificación de IgE específica permitió rápidamente disponer de sueros humanos con altas cantidades de IgE específica con los que se pudo determinar dónde residían las fracciones con mayor capacidad de unir IgE durante la separación de los extractos alergénicos por métodos físicos usuales en aquella época, tales como separación por peso molecular e intercambio iónico. Comenzaba entonces la caracterización de proteínas mediante separación en geles y tinción de las mismas, que fue rápidamente aplicada en el estudio de alergenos. Todo ello permitía que partiendo de una cantidad de varios gramos de materia prima pudiera obtenerse tras largos y costosos procesos miligramos de alergenos con un grado razonable de purificación (cercano al 99%). Aprovechando la tecnología incipiente en Biología molecular fue posible
obtener la secuencia íntegra de aminoácidos de algunos alergenos y la
secuencia amino-terminal de otros muchos, con lo que se dispuso de las
primeras informaciones sobre la naturaleza de los alergenos. Se esperaba
de estos estudios obtener una respuesta clara sobre la razón por la cual
estas moléculas inducían la síntesis de IgE. Como bien sabemos, esta
pregunta carece todavía hoy de una respuesta convincente, pero generó un
avance indudable en el conocimiento de los alergenos más importantes.
Una vez obtenidos antígenos nativos purificados se produjeron
anticuerpos policlonales contra los mismos lo que permitió obtener dos
logros significativos: por un lado se dispuso de métodos que ofrecían
una visión más amplia de las posibles reacciones cruzadas entre
alergenos y por otro permitió las primeras cuantificaciones del
contenido en alergenos de los diferentes extractos usados para métodos
in vivo e in vitro. Como es obvio, los antisueros diferían en actividad
de lote a lote e incluso la respuesta entre los diferentes animales no
era constante lo que producía enormes problemas en la estandarización,
pero su uso mejoró sin duda la calidad de los extractos utilizados en
alergología, haciendo posible una cierta medida de la capacidad
alergénica de los mismos. Los principales avances en los métodos serológicos se han producido en los años 80 gracias a la combinación de dos hechos:
En conjunto, la aparición de métodos ELISA hizo posible disminuir los
costes y acortar los tiempos de los ensayos y han sido aplicados
ampliamente en alergología. La investigación básica consiguió obtener por fusión celular entre un
linfocito y una célula plasmática tumoral (no productora de anticuerpos)
líneas celulares productoras de anticuerpos con especificidad deseada
que podían ser inmortalizadas bien mediante cultivo in vitro o
expandidas in vivo mediante crecimiento en peritoneo de ratón (6). En el
campo de la alergología, este hallazgo permitió obtener antisueros
contra IgE de afinidad y especificidad constantes lo que mejoró la
calidad de los inmunoensayos que se hacían hasta el momento. A la vez
posibilitó la obtención de antisueros contra alergenos de alta calidad
que son empleados en sustitución de los antisueros policlonales. El desarrollo de los métodos bioquímicos puso al alcance de la mano la
determinación de proteínas separadas por peso molecular o punto
isoeléctrico (7). Ambos métodos se basan en la separación previa de los
componentes de un extracto bruto (por ejemplo, un lisado celular). Una
vez separados los componentes se procede al revelado de la proteína de
interés previa inmovilización sobre una fase sólida, habitualmente una
membrana de nitrocelulosa (8). Como es lógico, para la detección se
aplicaban todos los avances conseguidos en los marcajes de antisueros
empleando sustratos insolubles para visualizar el sitio de combinación
entre los antígenos inmovilizados y los antisueros (poli o monoclonales)
marcados. Aplicado el método a nuestro caso, el método permitía por
primera vez determinar no sólo si una muestra poseía IgE específica
contra un alergeno, sino contra qué alergenos dentro de un extracto
bruto iban dirigidos dichos anticuerpos, lo cual es en sí mismo un
concepto revolucionario, ya que permite distinguir las especificidades
de las respuestas individuales. A lo largo del tiempo ha prevalecido de
una manera aplastante la separación por peso molecular obtenida mediante
SDS-PAGE sobre la separación por isoelectroenfoque. La Alergología encuentra en la Biología molecular desarrollada en otras
disciplinas la solución a muchos de los problemas inherentes al empleo
de alergenos nativos. La escasa concentración en la que éstos pueden
estar contenidos en el extractos crudos, la variabilidad en el
rendimiento, el coste de su purificación y otra serie de desventajas
quedan teóricamente solucionadas mediante la producción de alergenos
recombinantes que garantizan un suministro continuo de proteínas a bajo
coste. La realidad práctica ha demostrado que pueden existir toda una
serie de problemas que dificultan la obtención de recombinantes y que
una vez producidos éstos dispongan de la conformación adecuada para
poder ser reactivos útiles, pero en la actualidad se dispone de cientos
de alergenos expresados en bacterias o levaduras cuya aplicación en
clínica y diagnóstico comienza a rendir sus frutos y es de esperar que
su uso se incremente en poco tiempo. El desarrollo alcanzado en la caracterización de antígenos de membrana, la producción de anticuerpos monoclonales y los avances informáticos han posibilitado el estudio de la activación de los basófilos mediante técnicas de citometría de flujo. En la actualidad es posible disponer de una alternativa exvivo que ya ha demostrado ampliamente su utilidad incluso en diagnóstico, especialmente en alergenos nuevos o poco estandarizados. Microarrays: El desarrollo de la informática con la capacidad de procesar gran volumen de información en corto tiempo, el desarrollo de la tecnología y los conocimientos que han ido desarrollándose principalmente en genética hicieron necesario el desarrollo de métodos de rastreo miniaturizados conocidos como microarrays. Posteriormente, éstos métodos fueron aplicados en sistemas miniaturizados de búsqueda de anticuerpos o antígenos y entre ellos han encontrado aplicación en el campo del diagnóstico alergológico, dando ya los primeros pasos en práctica clínica. En su mayor parte emplean proteínas recombinantes fijadas sobre portas de vidrio, pero se han desarrollado también métodos con extractos completos de alergenos, con buenas evaluaciones iniciales en general. Dado que la miniaturización es inherente a éstos métodos, el número de teóricos alergenos capaces de ser estudiados conjuntamente podría ser de varios miles y este hecho pude transformar el panorama actual del diagnóstico en Alergología. Por ello cabe esperar que en un próximo futuro representen una alternativa diagnóstica de gran valor. Bibliografía:
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