Resumen
Los alérgenos recombinantes son herramientas prometedoras para el diagnóstico y la terapia de las enfermedades alérgicas frente a la utilización actual de extractos completos. En terapia, la tendencia es buscar moléculas hipoalergénicas que hayan perdido sus epítopos IgE, pero que mantengan una buena antigenicidad (epítopos T). Hasta la fecha sólo se han descrito dos alérgenos mayoritarios, denominados Par j 1 (15 kDa) y Par j 2 (11 kDa), en el polen de Parietaria judaica. Después de estudiar 3 diferentes fusiones de Par j 1+Par j 2, se han obtenido dos moléculas hipoalergénicas (fusión 1 y 2) que muestran en ensayos in vitro su potencialidad para poder ser utilizadas en el tratamiento de la alergia al polen de P. judaica.

1. Los alérgenos del polen de Parietaria judaica
1.1. Introducción
Parietaria es un género de malezas dicotiledóneas de la familia Urticaceae ampliamente distribuido a lo largo de la costa mediterránea [1] (Figura 1). Las especies más comunes son P. judaica y P. officinalis, si bien también se pueden encontrar otras especies, como P. lusitanica, P. mauritanica, y P. cretica. La presencia del polen de este género se ha descrito también en el sur del Reino Unido, Austria, regiones templadas de Europa central y del este, Australia y California [2].
La prevalencia de la sensibilización al polen de Parietaria puede ir del 20-40% en España y Francia, hasta el 80% en Grecia e Italia. Una importante característica de este género es la larga época de polinización que, dependiendo del clima, puede comenzar en Febrero-Marzo y mantenerse casi durante el resto del año. Consecuencia de este largo periodo de polinización, es la presencia de pacientes alérgicos con síntomas casi perennes, desde rinoconjuntivitis leve hasta asma severo.

1.2. Alérgenos mayoritarios
Se ha demostrado que fracciones proteicas del polen de P. judaica y P. officinalis de una masa molecular en el rango de 10-14 kDa son las responsables de prácticamente toda la potencia alergénica de sus extractos. Se han clonado los dos alérgenos mayoritarios del polen de P. judaica denominados Par j 1 y Par j 2 [3-4]. Ambas proteínas cuentan en su secuencia con la presencia de 8 resíduos de cisteína implicados en la formación de 4 puentes disulfuro (C4-C52, C14-C29, C30-C75, y C50-C91 (Par j 1)/C50-C90 (Par j 2) [5]. Ambos alérgenos pertenecen a la familia de proteínas no específicas transportadoras de lípidos (ns-LTPs). Así mismo, se han descrito posibles epítopos continuos de unión a IgE en ambos alérgenos [6] que estarían situados en zonas estructuralmente relacionadas (Figura 2 y Figura 3).

1.3. Diagnóstico molecular de la alergia a P. judaica
Se ha demostrado que mezclas de unos pocos alérgenos recombinantes pueden reproducir la complejidad alergénica de los extractos naturales de los cuales proceden, al contener los epítopos IgE más importantes presentes en dichos extractos: Phl p 1 y Phl p 5 en el caso de P. pratense, Bet v 1 en B. verrucosa, Alt a 1 en Alternaria alternata, o nDer p 1 y rDer p 2 en D. pteronyssinus. Por lo tanto, un limitado número de alérgenos recombinantes pueden ser suficientes para diagnosticar a la mayoría de los pacientes con alergia a una determinada fuente alergénica mediante el uso del diagnóstico por análisis de componentes (CRD, del inglés Component Resolved Diagnostic) [7].
Además, estas pruebas diagnósticas pueden ayudar a determinar la conveniencia de la inmunoterapia específica con extractos alergénicos. Así, en el caso de la alergia a polen de P. judaica se pueden utilizar el alérgeno marcador mayoritario (rPar j 2) y dos alérgenos minoritarios (rPar j 3 y rPar j 4) que presentan reactividad cruzada con pólenes de otras fuentes alergénicas no relacionadas [8]. Aquellos pacientes sensibilizados frente al alérgeno mayoritario serán los más adecuados para un tratamiento de ITE frente a polen de P. judaica (Figura 4), mientras que los pacientes que también son positivos a los alérgenos que presentan reactividad cruzada son menos adecuados para dicho tratamiento.

2. Inmunoterapia específica
La inmunoterapia, desde sus comienzos a principios del siglo XX, se ha basado en la administración de extractos alergénicos completos. Estos extractos son mezclas complejas de biomoléculas hidrosolubles, principalmente proteínas, glicoproteínas y carbohidratos, preparadas a partir de aquellas materias primas que producen las reacciones alérgicas. Como consecuencia de esta situación se pueden presentar una serie de problemas tales como:

• Aparición después de la inmunoterapia de nuevas sensibilizaciones a otros alérgenos presentes en la vacuna, para los cuales el paciente no estaba sensibilizado previamente.
• Dificultades de estandarizar la producción de los extractos alergénicos (caracterización físico-química de los alérgenos, y valoración de la actividad alergénica total).
• Reacciones adversas graves debidas a la reactividad de la vacuna con anticuerpos IgE de las células efectoras.

Un mayor conocimiento de los procesos alérgicos y de los mecanismos de ITE ha permitido una disminución, y en algunos casos eliminación, de las reacciones adversas. El conocimiento de la influencia de la presentación del antígeno mediada por IgE en respuestas TH2 específicas de alérgeno ha incrementado los esfuerzos en generar alérgenos modificados con menor afinidad por las IgE. Hoy en día se utiliza la ITE con alérgenos modificados con el fin de inactivar los epítopos IgE, disminuyendo por tanto, e incluso anulando, la unión a IgE y en consecuencia las reacciones adversas [9]. De esta manera, se evita el entrecruzamiento IgE en la superficie de las células efectoras y la presentación de antígeno dependiente de IgE. El alérgeno modificado será dirigido a las células T a través de un mecanismo de captación de antígeno por las células presentadoras mediado por fagocitosis o pinocitosis. Esto induce un balance de producción de citoquinas TH0 o TH1 por parte de las células T, una menor producción de IgE y mayor de IgG por parte de las células B, lo que conducirá a la inducción de una tolerancia de células T tipo TH2 sin riesgo de anafilaxis [10].
Por tanto, para una ITE segura y satisfactoria, es necesaria la eliminación en los alérgenos de los sitios de unión a los anticuerpos IgE así como el mantenimiento de los sitios de reconocimiento para las células T (epítopos T). Es decir, moléculas hipoalergénicas con una baja alergenicidad, pero que mantengan una buena antigenicidad (epítopos T).

2.1. Vacunas hipoalergénicas
El progreso de las técnicas recombinantes aplicado a la obtención de alérgenos y derivados de alérgenos ha permitido desarrollar nuevas vacunas para el tratamiento de la alergia. El desarrollo de vacunas hipoalergénicas se ha mejorado gracias a la posibilidad de mutar y/o eliminar epítopos IgE, así como al fraccionamiento, oligomerización y modificación química de los alérgenos. Así mismo se han obtenido moléculas híbridas de dos o más alérgenos mayoritarios, o derivados de éstos, en un intento de reducir los posibles efectos adversos derivados de la inmunoterapia.
Otras estrategias para reducir la actividad alergénica de las vacunas se basan en la inmunoterapia con péptidos conteniendo tanto epítopos T como B y la utilización de oligonucleótidos que contengan motivos específicos (CpG) que actuarían como potentes adyuvantes para respuestas de tipo TH1.

3. Vacunas hipoalergénicas de Parietaria judaica
3.1. Diseño
Se diseñaron diferentes fusiones de los dos alérgenos mayoritarios del polen de P. judaica. La primera era un híbrido que contenía la secuencia completa de los dos alérgenos. En la segunda se quitó una región (residuos 28 a 52) implicada en el mantenimiento de la estructura tridimensional y en la unión de IgE. La última construcción resulta prácticamente idéntica a la fusión 2 en la que se había eliminado una secuencia adicional (residuos 72 a 79 en Par j 1 y residuos 73 a 80 en Par j 2) relacionada con la unión a IgE (Figura 5) [11].
La expresión se realizó en un sistema bacteriano, E. coli, obteniéndose proteínas con tamaños moleculares de: Fusión 1 ≈ 32 kDa; Fusión 2 ≈ 28 kDa; Fusión 3 ≈ 28 kDa.

3.2. Análisis
Para determinar las propiedades de unión a IgE de pacientes alérgicos a polen de P. judaica por parte de las tres fusiones, se llevaron a cabo ensayos de inmunotransferencia, EAST, ELISA, pruebas de reacción cutánea, y de proliferación de células mononucleares de sangre periférica (CMSP).

3.2.1. Inmunodetección
Una primera evaluación de las actividades de unión IgEs por parte de las fusiones 1, 2 y 3 se llevó a cabo mediante la técnica de inmunotransferencia utilizando una mezcla de sueros de pacientes alérgicos a P. judaica. Los ensayos de inmunotransferencia mostraron una capacidad de unión a IgE distinta entre las tres fusiones. En el caso de la fusión 1 existía reconocimiento de anticuerpos IgE aunque inferior al detectado para la mezcla de alérgenos naturales purificados (nPar j 1-nPar j 2) utilizados como control. La fusión 2 mostró un reconocimiento muy reducido, mientras que la fusión 3 no era reconocida en absoluto por los anticuerpos IgE presentes en el sueros de los pacientes[11].

3.2.2. ELISA y ELISA-inhibición
La reactividad de IgE a las tres fusiones se analizó mediante la técnica de ELISA con sueros individuales de pacientes alérgicos a polen de P. judaica. Sólo se detectó una reactividad a IgE significativa en el caso de la fusión 1, mientras que las fusiones 2 y 3 no mostraron prácticamente reactividad (Figura 6). En ensayos de ELISA-inhibición con una mezcla de sueros de pacientes alérgicos a P. judaica, la fusión 1 mostró un grado de inhibición de alrededor del 50% de la actividad de unión a IgE del extracto de polen de P. judaica, muy distinto al mostrado por las fusiones 2 y 3, pero bastante inferior al que presentó la mezcla nPar j 1-nPar j 2 (92%). Las fusiones 2 y 3 alcanzaron un grado máximo de inhibición alrededor del 60%, pero utilizando para ello una concentración de proteína 10000 veces superior a la necesitada por nPar j 1-nPar j 2.

3.2.3. Pruebas de reacción cutánea (prick)
Se realizaron pruebas in vivo de reacción cutánea en 30 pacientes para evaluar el carácter hipoalergénico de las fusiones 1, 2 y 3, utilizando diferentes concentraciones: 0,5- 5 y 50 μg/ml para la fusión 1 y 5, 50 y 250 μg/ml para las fusiones 2 y 3 (Figura 7).
Se puede comprobar que los valores correspondientes a las reacciones cutáneas de las tres fusiones resultan ser significativamente diferentes respecto al extracto y nPar j 1-Par j 2 (P<0,001 en todos los casos). Es de destacar que la concentración utilizada en el caso de nPar j 1-Par j 2 y la fusión 1 fue de 50 μg/ml, mientras que para las fusiones 2 y 3 la concentración era cinco veces superior (250 μg/ml) [11].

3.2.4. EAST
La determinación de IgE específica, utilizando la técnica de EAST, reafirmó los resultados obtenidos en la prueba cutánea. La fusión 1 mantenía la capacidad de unión a IgE respecto a nPar j -Par j 2 mientras que las fusiones 2 y 3 presentaban un descenso muy pronunciado en dicha capacidad (P<0,001 en ambos casos) (Figura 8) [11].

3.2.5. Proliferación de CMSP
Un requisito indispensable para la utilización de una molécula hipoalergénica en inmunoterapia es el mantenimiento de su antigenicidad (epítopos T). Por ello se llevó a cabo un estudio de linfoproliferación de CMSP procedentes de 13 pacientes alérgicos a P. judaica que se estimularon con las diferentes proteínas utilizadas en los experimentos.
Del análisis estadístico se pudo observar que el extracto, utilizado como control, presentaba una capacidad de estimulación antigénica similar al logrado por la mezcla de los alérgenos mayoritarios purificados, nPar j 1-Par j 2 (P=0,142). Igualmente las fusiones 1 y 2 mostraban unos valores no significativamente diferentes respecto a los obtenidos con el extracto (P= 0,152 y P= 0,294, respectivamente) y con nPar j 1-Par j 2 (P= 0,484 y P= 0,182, respectivamente) (Figura 9). Por el contrario, la fusión 3 presentaba capacidad de estimulación significativamente diferente de la obtenida con el extracto (P=0,002) y con nPar j 1-Par j 2 (P=0,004) [11].

4. Conclusiones
Las fusiones 1 y 2 son moléculas hipoalergénicas que podrían ser candidatas para desarrollar una inmunoterapia satisfactoria contra la alergia al polen de P. judaica.

Bibliografía

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3. Costa MA, Colombo P, Izzo V, Kennedy H, Venturella S, Cocchiara R, Mistrello G, Falagiani P, Geraci D. 1994. cDNA cloning, expression and primary structure of Par j 1, a major allergen of Parietaria judaica pollen. FEBS Lett. 341: 182-6.

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