El objetivo fundamental en el diagnóstico de las reacciones alérgicas a alimentos mediadas por IgE es el establecimiento de una asociación causal entre el alimento y las manifestaciones clínicas referidas por el paciente (que se recogen mediante la historia y la exploración clínica inicial) y la identificación del mecanismo IgE subyacente (mediante pruebas cutáneas y/o determinación de IgE sérica específica). En muchos casos la realización de estas pruebas precisa, para alcanzar el diagnóstico la realización de una provocación oral (PO).

Las técnicas de diagnóstico disponibles en la práctica clínica habitual en alergia se desarrollaron a lo largo del siglo pasado. A finales del siglo XIX se proponen las pruebas cutáneas como método de diagnóstico para las enfermedades alérgicas. Es a partir de los años 60, con la caracterización de la IgE como inmunoglobulina desencadenante de la respuesta alérgica, cuando se dispone de las primeras técnicas “in vitro”. En los años 90 se clonan los primeros alérgenos, lo que nos lleva a disponer de extensas librerías de alérgenos recombinantes para diagnóstico. Este avance crea la necesidad de nuevas técnicas de análisis masivo y simultáneo. El objetivo de esta nueva tecnología es pasar del diagnóstico basado en extractos alergénicos (formados por conglomerados de moléculas alergénicas y no alergénicas) al “diagnóstico por componentes”, es decir, establecer exactamente la molécula alergénica que es la causante de la reacción(1). La deficiente estandarización de los extractos actuales (expresión de alergenos en ciertas condiciones de maduración del alergeno, contaminación, infra-representación o degradación de alérgenos importantes) y el identificar la fuente alergénica, pero no las moléculas responsables de la reacción nos dificulta la labor de diagnóstico, manejo y tratamiento de los pacientes.

Un microarray o micromatriz es un soporte sólido plano (habitualmente un cristal tratado) en el que se encuentran inmovilizadas de manera ordenada (“arrayed”) cientos /miles de dianas. Este tipo de ensayos cumplen cuatro características: son sustratos planos, en los que dianas microscópicas (spots) son inmovilizadas formando filas y columnas y existe además una unión específica entre estas dianas inmovilizadas en el sustrato plano y moléculas en solución.

Tras la conclusión de la secuencia completa del genoma humano, de la que se dispone de un borrador en 2001 y se completa a finales de 2004(2), es necesario caracterizar funcionalmente 20.000-25.000 genes que codifican proteínas. La información generada no es abordable con las técnicas analíticas disponibles en ese momento, por lo el microarray surge como el ensayo más adecuado para este trabajo. En el campo de la genómica se han empleado los microarray en el conocimiento de las bases moleculares de la fisiopatología de las enfermedades, la identificación de nuevos genes marcadores (de diagnóstico, pronóstico, monitorización de la evolución o de la respuesta terapéutica) y el desarrollo de fármacos. El éxito del empleo de la tecnología microarray en el campo de la genómica da lugar a su expansión y adaptación a otros campos como el estudio de proteínas, reacciones enzimáticas o inmunológicas.

En el estudio de las respuestas alérgicas IgE mediadas, estos ensayos tienen una aplicación diagnóstica directa, describiendo patrones de reconocimiento inmunológico (distinción entre distintos grupos de pacientes) e indirecta, mejorando el rendimiento de las pruebas diagnósticas ya disponibles en la actualidad (conociendo epítopos se podrían fabricar extractos que mejorasen el rendimiento de estas pruebas). Una aplicación terapéutica potencial sería en el desarrollo de IT específicamente dirigida a esas regiones inmuno-dominantes.

La alergia a proteínas de leche de vaca (APLV) afecta aproximadamente al 2.5% de los niños menores de 2 años. El tratamiento consiste en instaurar una dieta de evitación y programar visitas regulares de seguimiento en las que se evalúa la evolución. Aunque la mayoría de los niños alcanza la tolerancia alrededor de los 4-5 años, el 15-20% de los níños con APLV no ha superado la enfermedad en la segunda década de vida(3-7).

La leche de vaca contiene 3g de proteína/100 mL e incluye al menos 25 proteínas distintas entre séricas y caseínas. Las proteínas de la leche son de los alérgenos mejor caracterizados, conociéndose la estructura primaria de la mayor parte de las variantes genéticas de as1-, as2-, b- y k-caseína, b-lactoglobulina y a-lactoalbúmina(8-11).
En los últimos años han surgido estudios que ponen de relevancia la asociación entre el reconocimiento de epítopos secuenciales y la persistencia en la alergia a alimentos. Estos estudios, en el caso de la leche han sido realizados en membranas SPOT®. Los trabajos que avalan esta hipótesis son trabajos meramente descriptivos de poblaciones homogéneas de pacientes con IgE específicas muy altas(12-18). No hay ningún estudio publicado que explore la utilidad diagnóstica en una población global de niños alérgicos a proteínas de leche de vaca en seguimiento. Por lo tanto, el objetivo del presente estudio fue determinar la especificidad y diversidad de anticuerpos IgE and IgG4 frente a epítopos secuenciales de αs1-, αs2-, β-, y k-caseinas, y b-lactoglobulina mediante un microarray de péptidos.

MÉTODOS
Pacientes
Para llevar a cabo el objetivo del estudio se reclutaron pacientes en la consulta de Alergia Infantil del Hospital Ramón y Cajal. Los pacientes incluidos fueron todos previamente diagnosticados de alergia a proteínas de leche de vaca mediada por IgE. El diagnóstico se realizó en base a una anamnesis compatible con una reacción inmediata y la presencia de pruebas cutáneas (PC) positivas con leche y fracciones (ALA, BLG y CAS) y/o sIgE mediante CAP System FEIA [Phadia; Uppsala, Sweden]. Se realizaron además provocaciones orales en el caso de historia clínica no compatible. Siguiendo la práctica clínica habitual los pacientes fueron puestos en dieta de exclusión durante 6 meses. Se re-evalúa a los pacientes tras la dieta y se realizan de nuevo pruebas cutáneas e IgE específica. Aquellos pacientes con una IgE frente a leche < 2.5 KU son citados para una provocación oral con leche simple ciego, Gold Standard para establecer si un paciente ha alcanzado la tolerancia.
En función del resultado de la prueba los pacientes se dividieron en dos grupos: Tolerantes y Reactivos. El estudio fue aprobado por el CEIC Hospital Ramón y Cajal.

Péptidos e inmunoensayo
Para este ensayo se sintetizaron comercialmente péptidos con una longitud de 20 mer y 3 off-set (JPT Peptide Technologies) cubriendo la secuencia primaria (lineal) de cada una de las proteínas estudiadas, αs1-, α s2-, β- y k-caseínas, y β -lactoglobulina. De esta manera cada péptido se diferencia del anterior en 3 aminoácidos hasta completar toda la secuencia. Los péptidos se imprimen en triplicado en cristales epoxy (ArrayIt) mediante un robot de impresión (NanoPrint™ Microarrayer 60, TeleChem International, Inc.). Se incubaron los cristales con suero de los pacientes (dilución 1:5) y como anticuerpo secundario se empleó un cocktail 1:1 de anti-IgE (Phadia) y anti-IgG4 (Pharmigen) humano monoclonal de ratón marcados con Alexa 546 y Alexa 647 (Molecular Probes) respectivamente. Por último los cristales fueron escaneados (ScanArray®Gx, PerkinElmer) y las imágenes almacenadas como archivos TIFF.

Análisis
La señal de fluorescencia de dos canales (para IgE e IgG4) fue digitalizada (para cada spot fluorescente se obtiene un valor de intensidad), normalizada, depurada y transformada logarítmicamente para los análisis estadísticos posteriores.
Para determinar asociaciones estadísticas se utilizó el test exacto de Fisher. Se consideró significativa una p<0,05.
Los péptidos con una intensidad (medida como Signal-Noise-Ratio, SNR) de IgE/IgG4 por encima de 1 fueron considerados ‘péptidos positivos’.Aquellos péptidos positivos que reconocían más del 75% de los pacientes se consideraron epítopos. Se definieron los péptidos que estadísticamente estaban asociados al grupo de pacientes con provocación oral positiva.

Resultados
Finalmente se incluyeron en el estudio 31 pacientes entre enero de 2005 y febrero de 2006. La mediana de edad fue de dos años y cuatro meses para ambos grupos (entre 1 y 6 años). El síntoma más frecuente en el momento del diagnóstico fue la urticaria aislada seguida de urticaria y síntomas digestivos. Se realizó provocación oral en 29 de los 31 pacientes. Los dos pacientes restantes tuvieron transgresiones sintomáticas inmediatas con leche en su domicilio, el primero presentó urticaria y el segundo urticaria y vómitos. Uno de los pacientes tuvo una transgresión asintomática y la tolerancia fue posteriormente confirmada en su domicilio. 16 pacientes tuvieron una provocación positiva y 15 toleraron la leche. La IgE total mediana fue70 kU/l (2->2000) en el grupo tolerante y 39 kU/l (17-323) en el grupo reactivo. En cuanto a la IgE específica de leche fue 2.1 kUA/l (0.39-7.32) en los tolerantes y 1.9 kUA/l (0.38-13) en los reactivos. No se encontraron diferencias significativas en la presentación clínica, edad, sexo o niveles de IgE entre ambos grupos (tabla 1).

Tabla 1. Características clínicas de ambos grupos (tolerantes y reactivos).

*Edad y valores de IgE son en el momento de la provocación.

Tal y como se muestra en la tabla 2 hay varias regiones en cada una de las proteínas estudiadas, que fueron reconocidas por más del 75% de los pacientes reactivos y fueron considerados por lo tanto epítopos. Posteriormente se buscaron aquellos epítopos estadísticamente asociados con el grupo de pacientes que tuvieron una provocación oral positiva con leche (tabla 3). Se han encontrado 10 epítopos, a _s1 caseína: AA 28-50, a _s2 caseína: AA 1-20, 13-32, 67-86 y 181-207. ß-caseína: AA 25-50, 52-74 y 154-173. ß-lactoglobulina: AA 58-77. k-caseína: AA 34-53. La figura 1 representa, en un diagrama de cajas y bigotes, estos diez epítopos (eje X) frente al ratio IgE/IgG4 SNR (eje Y). Se muestran la mediana y el rango intercuartílico.

Tabla.2 Péptidos reconocidos por más del 75% de los pacientes.

AA: aminoácido. En la tabla se muestra, para cada proteína estudiada, la posición inicial y final del péptido en la secuencia primaria (lineal) de la proteína.

Tabla 3. Epítopos asociados con el grupo de pacientes con provocación positiva.

AA: aminoácido. Se muestra, para cada epítopo definido, el porcentaje de reconocimiento entre el grupo de los reactivos y para el grupo de tolerantes.

Figura 1. Intensidad de los epítopos asociados con el grupo de pacientes reactivos comparados con el grupo tolerante.

CONCLUSIONES

• Se trata del primer trabajo de la literatura que ha explorado la utilidad diagnóstica de la identificación de epítopos lineales mediante microarray en niños alérgicos a proteínas de leche de vaca.

• Varias regiones han sido identificadas como epítopos, mostrando que hay un patrón de reconocimiento diferente entre los pacientes tolerantes y reactivos.

• Este estudio representa un paso preliminar en el objetivo de encontrar mejores instrumentos de diagnóstico para determinar si un paciente ha alcanzado la tolerancia clínica a la leche de vaca.

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