Resumen

Revisión bibliográfica y aportación propia de la utilidad de la tecnología de microarrays de péptidos de proteínas alergénicas en el diagnóstico de la alergia a los alimentos

Introducción

Los ‘microarray’ o micro-matrices en español, son matrices bidimensionales de alta densidad donde se ha inmovilizado un material, que se utiliza como sonda biológica, y que puede ser ácidos nucleicos (Oligonucleótidos o cDNA), proteínas, (anticuerpos, enzimas), pequeñas moléculas, etcétera. Los “microarrays” poseen cuatro características: (a) son sustratos planos, en los que (b) dianas microscópicas son inmovilizadas (c) formando filas y columnas y (d) existe además una unión específica entre estas dianas inmovilizadas en el sustrato plano y las moléculas en solución. (Fig.1).

Desde su introducción en 1995 (1), los ‘microarrays’ se han expandido rápidamente en todas las áreas principales de la investigación en biomédica, incluyendo la expresión génica, las señales de transducción, la inflamación, el cáncer, el ciclo celular, la replicación del DNA, el estrés oxidativo, los ciclos hormonales, las enfermedades neuro-degenerativas, las infecciones, el citoesqueleto y el tráfico de proteínas. El éxito del empleo de la tecnología “microarray” en el campo de la genómica ha dado lugar a su expansión y adaptación al estudio de proteínas, reacciones enzimáticas o inmunológicas.

La mayoría de las reacciones alérgicas frente a los alimentos son mediadas por Anticuerpos de clase IgE. La unión del alergeno con su inmunoglobulina IgE pone en marcha los fenómenos de degranulación de las células efectoras (mastocitos y basófilos) y la liberación de histamina y el resto de mediadores que dan lugar a los síntomas de alergia. Los grupos de aminoácidos de las proteínas alergénicas que se unen a los anticuerpos de clase IgE se llaman epítopos de unión a anticuerpos IgE o epítopos de células B. Existen dos tipos de epítopos IgE , los secuenciales o lineales y los conformacionales (2). Los epítopos secuenciales están compuestos por una secuencia de aminoácidos contiguos mientras que en los epítopos conformacionales los epítopos están definidos por aminoácidos que se organizan de forma contigua por la estructura terciaria de la proteína alergénica.

Técnicas para identificación de péptidos alergénicos

Clásicamente en los alimentos como huevo, leche, pescados o leguminosas, sus proteínas mantienen su capacidad alergénica a pesar de los procesos de calentamiento y digestión , y por lo tanto, tienen una gran importancia los epítopos secuenciales (estructura primaria), mientras que para otros alimentos como frutas y verduras, los alergenos conformacionales parecen ser los más relevantes.

La identificación y mapeo de los epítopos alergénicos IgE pueden proporcionar una información adicional para el diagnóstico y pronóstico de la alergia a los alimentos. Recientes hallazgos apuntan a que los pacientes con alergia persistente o con formas más graves de enfermedad reconocen mayor número de epítopos secuenciales que conformacionales [3–8].

Entre los métodos para determinar los epítopos secuenciales de células B destaca la tecnología basada en las membranas SPOT (5,9) y en la plataforma de microarrays. En ambos sistemas se disponen los péptidos solapantes de la proteína alergénica a estudio.

Las diferencias entre el sistema de membranas SPOT y la plataforma de microarrays se recogen en la tabla I. Para la caracterización del perfil antigénico de los pacientes individuales las membranas SPOT muestran un mayor número de desventajas: La síntesis de un gran número de péptidos es costosa en términos de tiempo, dinero y cantidad de suero necesaria para el ensayo, además se pueden testar un número muy limitado de pacientes. Los microarrays de péptidos tienen mayor precisión y sensibilidad que las membranas SPOT, y se pueden testar un gran número de pacientes.

Hasta la fecha la mayoría de los datos conocidos referentes a la importancia de los epítopos lineales han sido generados mediante ensayos con membranas SPOT, sin embargo, las ventajas que suponen la utilización de los microarrays de péptidos hace que se esté utilizando cada vez más esta tecnología en el mapeo de epítopos de proteínas alergénicas de diferentes alimentos. La primera aplicación del sistema de microarrays fue para determinar los epítopos que ligan IgE en los alergenos mayores del cacahuete Ara h 1, Ara h 2 and Ara h 3. (10). Posteriormente se han aplicado para la descripción de patrones de reconocimiento de epítopos de las proteínas de la leche en los pacientes alérgicos (11)

Relación entre el patrón de reconocimiento de epítopos y la clínica de los pacientes

Con los datos actuales, se puede plantear que la identificación de los epítopos que unen IgE específica va a proporcionar una mayor información sobre el pronóstico y diagnóstico de la alergia a un alimento que la medición aislada de los niveles de IgE específica frente al alimento. Se ha establecido una correlación entre el número de epítopos de reconocimiento y la persistencia o gravedad de la alergia a proteínas de leche de vaca y huevo, de forma que los pacientes con alergia persistente y reacciones más graves reconocen a mayor número de péptidos. Se ha podido establecer un número de epítopos secuenciales denominados epítopos informativos que son reconocidos por la IgE de los niños que van a permanecer como alérgicos a lo largo del tiempo, hecho que no ocurre en los que desarrollan tolerancia de forma temprana (4,12); es decir, se ha podido establecer un paralelismo entre el reconocimiento de determinadas zonas en la secuencia lineal de la proteína y patrones clínicos de peor pronóstico, pacientes con alergia persistente.

Además, un estudio con pacientes con alergia a proteína de leche de vaca se pudo establecer diferencias entre epítopos de reconocimiento en pacientes con provocación oral positiva frente a los que tuvieron un resultado negativo, apuntando la posible utilidad de los microarrays como herramienta para el seguimiento de los pacientes alérgicos (11).

Los estudios en pacientes con alergia al huevo son escasos (6,13) y sólo se han realizado con membranas SPOT (6), si bien se ha podido establecer que los pacientes con alergia persistente al huevo reconocen mediante IgE específica más epítopos secuenciales frente al ovomucoide y ovoalbúmina, considerados los alergenos mayores del huevo, que los pacientes con alergia de poco tiempo de evolución. Se han identificado cuatro epítopos secuenciales en el ovomucoide que sólo son reconocidos por pacientes con alergia persistente (6).

Desde el año 2006 se ha desarrollado en el Hospital Ramón y Cajal una plataforma para el estudio de los perfiles de reconocimiento de péptidos lineales de las proteínas de leche y huevo en niños alérgicos a estos alimentos. Se ha llevado a cabo con financiación pública FIS (PI 08/1906, PI07/90717) y privada (SEAIC 2004, 2007), en una colaboración estrecha de los servicios de Alergia, Bioquímica-Investigación (unidad de microarrays) y la Unidad de Bioestadística. Esta plataforma tiene capacidad para llevar a cabo todos los pasos necesarios para el estudio de reconocimiento de anticuerpos partiendo de una reacción inmunológica tipo I (Fig. 2). Las fases de la técnica son: impresión de péptidos sintéticos que se solapan hasta completar la proteína, reacción de reconocimiento, amplificación de señal, escaneado y análisis de los resultados (14). Tras la puesta a punto de la técnica, como primer resultado preliminar se han podido establecer unos péptidos que se agrupan y son reconocidos por más de un 20% del total de pacientes estudiados (n=16) con alergia persistente a huevo e IgE específica frente a ovomucoide mayor a 5 KU/l, criterios de inclusión de los pacientes en el ensayo. (Fig. 3).

Cuestiones por resolver

Los estudios orientan hacia la existencia en la alergia a los alimentos de fenotipos clínicos que se correlacionarían con patrones de reconocimiento; sin embargo, existen aún aspectos por resolver: Los patrones de reconocimiento son muy distintos según el alimento, por lo que también hay que tener en cuenta el balance de reconocimiento entre epítopos lineales y conformacionales según el alimento de que se trate. Existe un solapamiento en el reconocimiento de péptidos entre los pacientes y una gran variabilidad individual. Sería muy interesante, explicar la relevancia “in vitro” de estos péptidos por otros ensayos biológicos (activación de basófilos). Otro aspecto muy limitante de esta tecnología es el tratamiento estadístico de los datos. Por último, en cuanto al diseño de estudios, son necesarios estudios prospectivos y con grandes muestras de pacientes que permitan confirmar los hallazgos obtenidos hasta la fecha.

Conclusiones

La tecnología microarrays de péptidos ofrece la posibilidad de determinar patrones de reconocimiento que pueden tener una aplicación clínica. Supone una gran oportunidad de estudio “in vitro” de la respuesta IgE, identificación de epítopos B, que pueden ser utilizados para analizar la historia natural de la alergia a un alimentos y las modificaciones tras tratamientos como la inmunoterapia o inducción de tolerancia con alimentos.

Bibliografía

1. Schena M, Shalon D, Davis RW, Brown PO. Quantitative monitoring of gene expression patterns with a complementary DNA microarray. Science. 1995;270:467-470.

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11. Cerecedo I, Zamora J, Shreffler WG, et al. Mapping of the IgE and IgG4 sequential epitopes of milk allergens with a peptide microarray-based immunoassay. J Allergy Clin Immunol 2008; 122:589–594.

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14. Lin J, Bardina L, Shreffler WG, Andreae DA, Ge Y, Wang J, Bruni FM, Fu Z, Han Y, Sampson HA. Development of a novel peptide microarray for large-scale epitope mapping of food allergens. J Allergy Clin Immunol. 2009 Aug;124(2):315-22