Resumen

El diagnóstico y tratamiento de la alergia depende de la disponibilidad de extractos alergénicos de calidad, lo que significa que hayan sido producidos siguiendo buenas prácticas de fabricación y controlados por un sistema de calidad que garantice su consistencia. La cuantificación de alérgenos relevantes mediante ELISA de doble fase permite calcular las proporciones de los alérgenos revelantes presentes en los extractos alergénicos. Se ha desarrollado y validado un ELISA que permite cuantificar el alérgeno mayoritario en extractos de polen de Salsola kali para uso clínico. Se han detectado alérgenos relacionados con Sal k 1 en el polen de otras especies pertenecientes al mismo grupo polínico que podrían explicar, en parte, la reactividad cruzada encontrada entre estos pólenes. La utilización de este ensayo abre nuevas posibilidades para la cuantificación de proteínas alergénicas en muestras medioambientales, que pueden ayudar a estudiar la correlación entre síntomas y presencia del alérgeno desencadenante.

Introducción

El único tratamiento curativo de la alergia es, hoy en día, la inmunoterapia específica. Para el diagnóstico y tratamiento de la alergia se necesitan extractos de calidad lo que quiere decir que se deben producir siguiendo buenas prácticas de fabricación y controlados por un sistema de calidad que garantice la consistencia entre los lotes producidos. Esto se consigue por medio de la producción estandarizada de extractos. Sabiendo que los extractos son mezclas complejas de componentes proteicos y no proteicos, que vienen de una materia prima variable como es el polen, los ácaros, los hongos, o los epitelios, la producción estandarizada no es tan sencilla como la de un medicamento químico tradicional cuya pureza e identidad se pueden demostrar, por ejemplo, con un único ensayo de HPLC. Spangford y Larsen en 2006, propusieron un control de los extractos alergénicos a tres niveles (1):

1. Determinación de la composición de alérgenos para asegurar que todos los alérgenos importantes están presentes. Normalmente se analiza por medio de electroforesis para separar todas las proteínas del extracto según sus masas moleculares, después mediante immunoblotting, se enfrentan a sueros de pacientes alérgicos a la fuente alergénica, para visualizar las proteínas fijadoras de IgE, es decir, los alérgenos.

2. Cuantificación de la actividad alergénica total para asegurar que la potencia alergénica se mantiene en los límites establecidos. Ésta se puede determinar in vivo, realizando en pacientes pruebas cutáneas con diferentes concentraciones de extracto y determinando la concentración que produce una pápula de un tamaño equivalente a la de la histamina. Este extracto caracterizado in vivo se denominará extracto estándar y sirve como referencia interna. Frente a él se comparan, in vitro, la potencia de los nuevos extractos por EAST-inhibición. Desafortunadamente, la medida de la potencia total no da una información completa, ya que no tiene en cuenta las proporciones de los diferentes componentes alergénicos individuales.

3. Cuantificación de alérgenos específicos para asegurar que los alérgenos esenciales están presentes en proporciones constantes. La EMEA, en su última guía de producción de extractos alergénicos establece la conveniencia de medir los alérgenos relevantes de los extractos y recomienda hacerlo por métodos inmunológicos (2).

Cuantificación de alérgenos relevantes mediante ELISA de doble fase

El objetivo fundamental de nuestro programa de desarrollo de métodos para cuantificar alérgenos relevantes es la mejora de la calidad de nuestros extractos alergénicos.

La primera decisión es definir qué alérgeno hay que medir, es decir, cual es un alérgeno relevante. Podemos considerar alérgenos esenciales o relevantes como aquellos que son responsables de la mayor parte de la actividad alergénica de un extracto. Seguidamente, es necesario definir cómo lo medimos. Tal y como lo recomienda la EMEA (2), el procedimiento más aceptado para cuantificar alérgenos es el ensayo de ELISA de doble fase o ELISA sándwich. Actualmente no hay un procedimiento certificado para este tipo de ensayos en alérgenos por lo que el Proyecto Europeo CREATE se definió con el objetivo de buscar ensayos y materiales de referencia para el desarrollo de métodos de ELISA aplicados a algunos alérgenos (3).

Para preparar un ensayo de ELISA se necesitan: anticuerpos monoclonales o policlonales específicos del alérgeno a cuantificar y este mismo alérgeno altamente purificado para utilizarlo como referencia. La técnica de los ensayos de sándwich consta de dos etapas (Fig. 1). La primera es la detección del alérgeno de interés, para ello se inmoviliza en los pocillos de una placa un anticuerpo monoclonal específico para dicho alérgeno. Posteriormente, se añade el extracto completo que contiene el alérgeno; éste será reconocido específicamente por el monoclonal inmovilizado y de esta forma al lavar la placa sólo se mantendrá unido el alérgeno de interés. En la posterior etapa, la de detección, se añade otro anticuerpo marcado enzimáticamente que se une al alérgeno, produciendo color cuantificable espectrofotométricamente al añadir un reactivo. De esta forma, cuando se añaden diferentes cantidades de un extracto se obtiene diferente grado de color según la cantidad de alérgeno que es capaz de detectar. La cantidad de alérgeno en la muestra se interpola a partir de una recta patrón obtenida ensayando en la misma placa el alérgeno purificado en cantidades conocidas.

Grupo polínico de Quenopodiáceas-Amarantáceas

Estas técnicas de análisis son las que se aplican a los extractos de polen del grupo de las Quenopodiáceas-Amarantáceas, un grupo botánico con importancia creciente desde el punto de vista alergénico. Las familias botánicas Quenopodiáceas (Chenopodiaceae) y Amarantáceas (Amaranthaceae), por la semejanza de sus granos de polen, constituyen un único grupo estenopalino (polen similar al microscopio óptico) por lo que habitualmente se tratan en la literatura conjuntamente. Aunque tradicionalmente se ha dividido en dos familias, según sistema APG (Angiosperm Phylogeny Group) basado en comparaciones moleculares, las Quenopodiáceas son una subfamilia incluida dentro de las Amarantáceas.

En la Península, se encuentran presentes en la atmósfera durante casi todo el año, con dos momentos de máxima concentración, el primero más suave, entre abril y mayo y el segundo entre agosto y septiembre donde se presentan las mayores concentraciones. Estos pólenes, son la primera causa de sensibilización en Toledo y Elche; la segunda en Logroño, y la tercera, en Zaragoza y Ciudad Real (4). Aunque la presencia de estos pólenes se ha definido tradicionalmente como restringida al Valle del Ebro y regiones secas de Murcia y Alicante, en la actualidad se extiende por todo el Este Peninsular seco asociado siempre a suelos y climas áridos con pocas precipitaciones.

ELISA para la cuantificación de Sal k 1

El polen de Salsola kali tiene gran importancia como desencadenante de reacciones alérgicas. Se han descritos 5 alérgenos de este polen (www.allergome.org), pero Sal k 1 parece ser el marcador de la sensibilización a este polen. La proteína Sal k 1 (Fig. 2, carril 2) fue purificada a partir del extracto de polen (Fig. 2, carril 1) utilizando una combinación de cromatografía de intercambio iónico y de tamizado molecular, hasta conseguir una pureza >95% (Fig. 2). La proteína purificada se identificó como Sal k 1 utilizando técnicas de proteómica, mediante el fraccionamiento y secuenciación de los péptidos resultantes, los cuales coincidían en un 60% con la secuencia de Sal k 1.0301. Esta proteína es reconocida por el suero de 40 pacientes alérgicos al polen de Salsola con una prevalencia del 84% (Fig. 3A). Sal k 1, además de ser un alérgeno mayoritario, es también un alérgeno relevante ya que en un ELISA-inhibición, la adición de cantidades crecientes de Sal k 1 puro, produce una inhibición de >90% en la unión de IgE al extracto completo (Fig. 3B).

Una vez purificado el antígeno, se inmunizaron ratones y conejos con la proteína purificada, para obtener los anticuerpos específicos. Se obtuvieron 18 anticuerpos monoclonales que fueron analizados. Después de numerosas pruebas, la combinación ideal fue: 5 µg/ml de 4C11 como captura y 0,25 µg/ml del antisuero marcado con biotina como detector. Con este ensayo se obtienen unas curvas utilizando Sal k 1 como proteína control que son paralelas a las del extracto, lo que indicaría que están midiendo la misma proteína.

Posteriormente se validó el ensayo en base a su precisión (concordancia entre los análisis múltiples), exactitud (capacidad de calcular el valor verdadero), sensibilidad, especificidad, y límite de detección (Fig. 4).

Sal k 1 tiene isoformas de diferentes pI entre 6,3 y 8,8. Estas isoformas fueron purificadas y ensayadas utilizando el ELISA desarrollado, observándose que todas ellas eran reconocidas por el ensayo con unas pendientes similares.

El contenido de Sal k 1 de los extractos del polen de S. kali ensayados estaba comprendiendo entre 22,5 y 28,7 mg/mg. Finalmente, se comprobó que existía una correlación estadísticamente significativa (r=0.92) entre el contenido en Sal k 1 y la capacidad fijadora de IgE del extracto.

Presencia de proteínas similares a Sal k 1 en otras Quenopodiáceas

Se detectó la presencia de proteínas antigénicamente similares a Sal k 1 en el extracto de polen de dos especies del grupo de Amarantáceas: Salicornia y Kochia. Estos extractos contenían, 0.6 µg/mg 4.2 µg/mg, respectivamente de la proteína equivalente a Sal k 1. Estos valores no indican realmente la cantidad de alérgeno de estos alérgenos ya que para esto se debiera utilizar como referencia las proteínas purificadas del polen de Salicornia y Kochia. Mediante immunoblotting, se pueden detectar en el polen de otras Amarantáceas, proteínas similares que también reaccionan con las IgE de pacientes alérgicos a Salsola (Fig. 5). Es de destacar que en el extracto del polen de Chenopodium, hay una proteína de 40 kDa que reacciona con el suero de los pacientes alérgicos a Salsola pero que no reacciona con antisueros anti-Sal k 1.

Cuantificación de Sal k 1 en muestras aerobiológicas

Un aspecto importante en el grupo de las Quenopodiáceas-Amarantáceas, debido a que forman un grupo estenopalino, es que sus contajes polínicos habitualmente son de todo el grupo, sin especificar especie polínica. Ésta puede ser una de las razones por las que no se ha visto una clara correlación temporal entre los contajes de pólenes de este grupo y la aparición de síntomas en pacientes monosensibilizados al polen de Salsola (5). El retraso de 15 días encontrado entre ambos eventos también podría ser debido a una liberación de alérgenos y posterior resuspensión de los mismos que sería los causantes de los síntomas cuando ya no hay polen en la atmósfera (5).

La medida directa mediante ELISA del contenido de los alérgenos en la atmósfera ha sido recientemente introducida (6). En este sentido, el ensayo de Sal k 1 desarrollado podría ser de gran ayuda, para lo cual se simularon las condiciones encontradas en las muestras aerobiológicas. Para ello se hicieron diluciones seriadas de polen de Salsola que se extrajeron en idénticas condiciones que las muestras de captadores y se analizaron por ELISA (Fig. 6). La alta sensibilidad del método permitía detectar el alérgeno Sal k 1 liberado por sólo 2 granos de polen, y tener medidas cuantificables a partir de 9 granos. Por lo tanto este sistema de ELISA puede permitir la cuantificación de la carga alergénica presente en la atmósfera debida a Sal k 1, lo que permitiría su posible correlación con la aparición de síntomas en pacientes sensibilizados.

Conclusión

El desarrollo de un sistema de ELISA para la cuantificación de Sal k 1 tiene múltiples aplicaciones en el campo de la alergia, para el control de calidad de los extractos de uso clínico, estudio de reactividades cruzadas, y valoración de contenido alergénico en la atmósfera.

Agradecimientos

El autor agradece a los Dres. Carlos Colas y Arantza Vega el suministro de sueros de pacientes alérgicos al polen de Salsola kali. Este trabajo ha sido subvencionado por Bial-Arístegui, Ministerio de Industria, Turismo y Comercio (Programa Nacional de Biomedicina, Acción PROFARMA, FIT-090100-2007-76), y Departamento de Industria, Comercio y Turismo, Gobierno Vasco (Programa INTEK BERRI INNOTEK, IT-2007/0000537).

Referencias

1. Spangfort MD, Larsen JN. Standardization of allergen-specific immunotherapy vaccines. Immunol Allergy Clin. North. Am. 2006; 26:191-206.

2. European Medicines Agency. Guideline on allergen products for human use. EMEA/CHMP/BWP/304831/2007.

3. van Ree R, Chapman MD, Ferreira F, Vieths S, Bryan D, Cromwell O, et al. The CREATE Project: development of certified reference materials for allergenic products and validation of methods for their quantification. Allergy 2008; 63:310-26.

4. Alfaya T, Marqués L. Quenopodiáceas-Amarantáceas. En Polinosis: Pólenes y Alergia (Editores: Cadahía A, Valero L). 2002. Pag. 69-78. Editorial Lab Menarini. Barcelona.

5. Colas C, Lezaun A. Russian thistle pollinosis: form allergen characterization to specific immunotherapy treatment. Front Biosci. 2009; 14:4652-7

6. Moreno-Grau S, Elvira-Rendueles B, Moreno J, García-Sánchez A, Vergara N, Asturias JA, et al. Correlation between Olea europea and Parietaria judaica pollen counts and quantification of their major allergens Ole e 1 and Par j 1-Par j 2. Ann Allergy Asthma Immunol 2006; 96:858-64.