INTRODUCCIÓN

Desde principios del siglo pasado y, especialmente desde su segunda mitad, se ha observado, sobre todo en los países industrializados, un notable incremento de las enfermedades alérgicas (1;2). No se dispone de una explicación clara para justificar este aumento. En 1989 Strachan observó, en una cohorte de más de 17.000 niños británicos seguidos hasta los 23 años, que existía una relación inversa entre la rinoconjuntivitis alérgica y el número de hermanos, proponiendo la que se ha venido a denominar hipótesis de la higiene (3). El autor aventuraba que un menor número de hermanos implicaría un menor número de infecciones durante la infancia, lo que, unido a una mayor higiene personal y ambiental permitiría una mayor expresión clínica de las enfermedades atópicas. Con posterioridad ha habido estudios que han apoyado la hipótesis de la higiene (4) aunque también ha sido criticada (5) e incluso casi puesta en solfa (6). Probablemente el mayor mérito de Strachan pueda haber sido llamar la atención sobre el papel que los aspectos ambientales pueden desempeñar en el desarrollo de las enfermedades atópicas. En cualquier caso, es indudable que la atopia en general y el asma alérgica en particular son enfermedades en las que el componente genético interactúa notablemente con el ambiental.

Se han realizado varios centenares de estudios sobre genes implicados en el asma y en la alergia. En muchos de ellos se han descrito asociaciones de polimorfismos de un único nucleótido (SNP) con determinados fenotipos de alergia o asma. No obstante, en muchos de los estudios el tamaño muestral no era adecuado para el análisis de enfermedades de herencia compleja. Además, muchos de los resultados no se han podido reproducir. En la actualidad, se puede decir que hay una cuarentena de genes que se han asociado con el asma en al menos un estudio realizado en muestras con más de 150 controles y 150 pacientes (7). No obstante, el efecto de estos polimorfismos por separado sobre el fenotipo de asma parece ser limitado, por lo que se han realizados estudios de haplotipos o diplotipos (8;9) y epistasia (10;11). Aún así, únicamente el efecto de los genes no es capaz de explicar el desarrollo del asma o de la alergia. En este sentido, dado que se trata de enfermedades que son el resultado de complejas interacciones entre genes y medio ambiente, en los últimos años se han publicado diversos estudios que han proporcionado pruebas sobre esta interacción (12). Tampoco así se han satisfecho por completo todas las observaciones referidas por los clínicos. Muy recientemente, se ha venido a introducir la epigenética como una posible pieza que podría llevar a aclarar las discordancias antes explicadas.

EPIGENETICA

Según el Diccionario de la Lengua, el término epigenética hace referencia a lo relativo al término epigénesis (epi- y -génesis) que es definida como una doctrina según la cual los rasgos que caracterizan a un ser vivo se configuran en el curso del desarrollo, sin estar preformados en el huevo fecundado. Por su parte el Medical Subject Headings (Pubmed) (http://preview.ncbi.nlm.nih.gov/sites/entrez), define la epigenética como un proceso por el cual el organismo adulto se desarrolla mediante mecanismos que conducen a la restricción de posibles destinos celulares, dando lugar, en último término, a su estado de diferenciación. Los mecanismos implicados producen cambios en las células sin originar cambios en el la secuencia del DNA. Entre ellos se encuentra la metilación del DNA, la modificación de las histonas. El momento de la replicación del DNA (DNA replication timing); el posicionamiento del nucleosoma y la heterocromatización dan como resultado la expresión o represión selectiva de genes dan como resultado la expresión o represión selectiva de genes. En un sentido lato, se podría considerar la epigenética como aquellos cambios heredables y reversibles en la expresión génica que se producen sin modificar la secuencia del DNA.

El DNA contiene la información genética de un individuo y determina sus características. En las células eucariotas el DNA se encuentra “empaquetado” por pequeñas proteínas básicas de 11-12 Kd denominadas histonas, de las que existen cinco clases (la histona H1, ligadora o de unión, y las histonas H2A, H2B, H3 y H4 o nucleosomales). Las histonas son las proteínas celulares más abundantes. Cerca de un 20% de los aminoácidos de las histonas está constituido por lisina o arginina, aminoácidos que les confieren su carácter básico. A través de las cargas positivas de las cadenas laterales de estos aminoácidos las histonas se unen a los grupos fosfato del DNA, que están cargados negativamente. Dos histonas H2A, H2B, H3 y H4 forman un octámero; alrededor de él se enrolla dos veces una hebra de ADN, denominándose nucleosoma al complejo DNA-histona. El DNA se enrolla alrededor del núcleo de la histona formando unos bucles de unos 147 pares de bases para, a continuación, desplazarse unos 20-70 bp en un giro hacia la izquierda hasta alcanzar el siguiente nucleosoma. Este DNA de conexión se encuentra desprovisto de histonas. Por su parte, las histonas H1 actúan como pieza de cierre en cada nucleosoma y van uniendo éstos. Se conforma así la cromatina, que puede aparecer como heterocromatina o cromatina densa y es inactiva desde el punto de vista transcripcional o como eucromatina o cromatina abierta, capaz de ser transcrita. Por su parte, las histonas pueden sufrir diversos procesos enzimáticos, como metilaciones, acetilaciones, fosforilaciones, ubiquitilaciones, sumoilaciones o ADP-ribosilaciones según se añadan grupos metil, acetil, fosforil, ubiquitil, sumoil o ADP-ribosil, respectivamente.

Como se ha comentado previamente, existen diversos mecanismos epigenéticos que implican cambios en la capacidad de transcripción de las secuencias del DNA. Los principales son la metilación del DNA y las modificaciones de las histonas, sin descartar otros procesos como el complejo Polycom-trithorax o los RNA no codificantes. . Nos centraremos en los dos primeros procesos.

Metilación del DNA

La metilación del DNA es la mejor conocida de las modificaciones epigenéticas y se produce en todas las células eucariotas. Consiste en la adición de un grupo metilo en la posición C5 de las citosinas de las islas de dinucleótidos CpG. Esto se debe a la acción de unas enzimas denominadas metiltransferasas del DNA (DNMT). En el ser humano se han descrito cinco DNMT, implicadas en la metilación de novo o en el mantenimiento de la misma. Estas islas CpG se encuentran distribuidas por todo el genoma, pero son especialmente frecuentes en las regiones promotoras. Cuando el DNA está metilado, se impide la unión de los factores de transcripción y se favorece la unión de proteínas que inhiben la transcripción (13). También afecta a la accesibilidad, que a su vez depende de la posición del nucleosoma y del desensamblado parcial de las histonas.

Modificaciones de las histonas

Este es el otro gran mecanismo de regulación epigenética. Como se ha dicho anteriormente, las histonas pueden sufrir procesos de metilación, acetilación, fosforilación, ubiquitilación, sumoilación o ADP-ribosilación. La más importante de ellas es al acetilación/desacetilación, que es llevado a cabo por 16 acetiltransferasas de histonas (HAT) y 10 desacetilasas de histonas (HDAC). En líneas generales, cuando las histonas están desacetiladas se inhibe la transcripción, mientras que cuando están acetiladas, se favorece. El conjunto de modificaciones postranscripcionales de las histonas se ha denominado código de histonas y de ello depende que la cromatina se encuentre abierta, y por tanto transcripcionalmente activa, o cerrada, y en consecuencia no accesible a la maquinaria de transcripción; en definitiva, que se puedan expresar o no los genes.

En último término la epigenética podría proporcionar el nexo entre el medio ambiente y la genética en el contexto de las enfermedades complejas. Son tres las razones que indican esta posibilidad (14). En primer lugar, las modificaciones epigenéticas influyen sobre el fenotipo; en este sentido, explicaría por qué los gemelos homocigotos presentan discordancias fenotípicas en el 25% de los casos, el fenómeno de la impronta (imprinting), los efectos del sexo o la distinta edad de comienzo de una enfermedad, por ejemplo. En segundo lugar, las modificaciones epigenéticas se pueden heredar. Así, algunos cambios epigenéticos se pueden trasmitir a lo largo de distintas divisiones celulares, como se ha descrito con el patrón de acetilación de las histonas en clones de células T humanas. Por último, los factores ambientales pueden inducir modificaciones epigenéticas, como se comentará más adelante. Desde el punto de vista de la epigenética y las enfermedades alérgicas, se discutirán dos aspectos fundamentales: epigenética, embarazo y asma y las modificaciones epigenéticas que se producen en los linfocitos T.

EPIGENÉTICA, EMBARAZO Y ASMA

Los períodos embrionario y fetal constituyen el momento más crítico en cuanto al programa de desarrollo del nuevo ser. La hipótesis sobre los orígenes de la enfermedad y la salud durante el período de desarrollo (Developmental Origins of Health and Disease, DOHaD) propone que determinadas interacciones ambientales que se producen durante los períodos prenatal y postnatal inmediato pueden inducir cambios permanentes en el metabolismo y la fisiología y condicionar, de este modo, el riesgo futuro de enfermar (15). En los últimos años esta hipótesis se ha visto relanzada por el apercibimiento de que las modificaciones epigenéticas podrían ser el sustrato de la DOHaD. A continuación se comentarán algunos efectos de las exposiciones maternas a algunos agentes ambientales durante el embarazo y el desarrollo posterior de asma.

Dieta materna durante el embarazo

Se sabe que las variaciones en la situación nutricional materna durante el embarazo son capaces de condicionar el programa de desarrollo fetal y el riesgo de enfermar en distintos órganos y sistemas y se ha implicado una serie de factores dietéticos durante el embarazo con el desarrollo del sistema inmunológico y el riesgo de alergia (16). Así, se ha publicado que la dieta mediterránea protege de las sibilancias en niños en edad preescolar (17) en general de la atopia (18). No obstante, hay estudios contradictorios (19). En lo relativo a algún nutriente concreto, los que parecen que pueda estar más en relación y mejor evaluados son los ácido grasos insaturados (PUFA). Así, se ha demostrado una reducción del riesgo de asma en un seguimiento a 16 años, si bien estos datos se obtuvieron de un registro obligatorio de visitas hospitalarias en vez de un seguimiento clínico con pruebas alérgicas (20). Por otro lado, Krauss-Etschmann y cols (21) observaron una disminución de moléculas Th2 (IL-4, IL-13 y CCR4) y un incremento de la expresión de mRNA para TGFb en la sangre de cordón umbilical de los niños cuyas madres habían recibido suplementos de aceite de pescado durante el embarazo.

Tabaquismo materno durante el periodo gestacional

El tabaquismo materno durante la época gestacional ejerce diversos efectos adversos sobre el feto, incluyendo un efecto deletéreo sobre la función pulmonar y sobre el riesgo de desarrollar asma. Se ha demostrado que el humo del tabaco puede reducir la expresión de genes mediante la hipermetilación de la región promotora de determinados genes normalmente expresados en el pulmón sano (22). Por otra parte se ha demostrado que el tabaquismo de la abuela materna durante el embarazo se asocia con un mayor riesgo de asma en el nieto, independientemente de si la madre fumaba o no y que cuando tanto la abuela como la madre habían fumado durante el embarazo el riesgo era más elevado (23).

Efecto de la medicación tomada por la madre durante la gestación

Se ha observado recientemente que la toma de antiácidos durante el embarazo se asoció con un riesgo más elevado de desarrollar alergia durante la infancia (24). También recientemente se ha asociado el consumo de paracetamol durante la gestación con un aumento del riesgo de asma (diagnosticada por un médico) a los 18 meses y a los 7 años y con un aumento de las hospitalizaciones debidas al asma. Este efecto fue superior si las madres habían tomado paracetamol durante el primer trimestre del embarazo (25).

Nacimiento por cesárea y frecuencia de atopia

Recientemente se han comunicado diversos estudios que sugieren que el parto instrumental con cesárea se asocia un mayor riesgo de desarrollar asma o atopia. Así, Tollanes y cols (26), en un estudio realizado en una población de 1.756.700 niños noruegos nacidos de partos no gemelares y seguidos hasta los 18 años de edad, encuentran que los nacidos por cesárea presentan un 52% más de riesgo de desarrollar asma en comparación con los nacidos por vía vaginal (índice de riesgo ajustado 1,52; IC95%:1,42-1,62), siento este riesgo mayor en los casos de cesárea urgente que en los casos de cesárea programada. Por su parte, Pistiner y cols, en un bien realizado estudio de seguimiento de una cohorte de 432 niños con antecedentes familiares de primer grado de atopia y seguidos hasta los 9 años de edad, concluyeron que el parto por cesárea se asoció con un aumento del riesgo de desarrollar rinitis (OR 1,8; IC95% 1,0-3,1) y atopia (OR 2,1; IC95% 1,1-3,9). En nuestro Servicio hemos podido comprobar, en un estudio realizado en una población de 205 niños alérgicos a las proteínas de la leche de vaca o al huevo que los primeros también presentaban un riesgo dos veces superior (OR 2,28; IC95% 1,05-4,98) de desarrollar pruebas cutáneas positivas frente a las proteínas de la leche de vaca (Macías E, Tesis Doctoral, Universidad de Salamanca, 2009). Recientemente se han publicado dos metanálisis (27;28) que evidencian un riesgo superior de atopia y enfermedades alérgicas en los niños nacidos por cesárea. En cuanto a los posibles mecanismos, se ha postulado que durante el parto por vía vaginal el recién nacido se podría contaminar con la microflora vaginal de la madre cuando pasa por el canal del parto materno, mientras que en el recién nacido por cesárea se produciría un retraso en la colonización por la microflora, lo que podría alterar la respuesta inmune a favor de un patrón Th2 que podría favorecer de manera eventual la respuesta IgE. También se ha propuesto que podría influir el tratamiento antibiótico que recibe la madre durante el parto por cesárea.

Ingestión de ácido fólico durante el embarazo

El ácido fólico se recomienda en las mujeres embarazadas para reducir el número de malformaciones neurológicas fetales. En algunos países, como los Estados Unidos, se añaden suplementos de ácido fólico a algunos alimentos, como los cereales. El ácido fólico constituye una fuente de donantes de grupos metilo para la metilación del DNA, con la posibilidad de inducir, en consecuencia, modificaciones epigenéticas. El ácido fólico se recomienda como suplemento a las mujeres embarazadas para reducir el riesgo de malformaciones congénitas en el feto. Recientemente se han realizado interesantes aportaciones al respecto. Se ha observado, en un modelo múrido, que los suplementos de ácido fólico durante el embarazo incrementan el riesgo de desarrollar atopia. En el hombre, Haberg y colaboradores (29) observaron que la administración de suplementos de ácido fólico durante el embarazo se asociaba con aumento del riesgo de sibilancias e infecciones del tracto respiratorio inferior en los niños. Sin embargo, Matsui y Matsui (30) han publicado recientemente un estudio en el que observaban que unos niveles elevados de folato sérico se relacionaban con unos niveles de IgE sérica total bajos y un menor riesgo de atopia y sibilancias. En nuestro caso, en el estudio anteriormente citado de 205 niños alérgicos al huevo o a la leche, observamos que los niños cuyas madres habían tomado ácido fólico durante el embarazo presentaron un menor porcentaje de rinoconjuntivitis, asma, y una menor sensibilización posterior a aeroalérgenos, en particular a los ácaros del polvo, esporas de hongos y epitelios de animales (Macías E, Tesis Doctoral, Universidad de Salamanca, 2009).

REGULACION EPIGENETICA DE LOS LINFOCITOS T

Se considera que la respuesta Th2 es característica de las reacciones o enfermedades alérgicas y se considera también que se contrapone con la respuesta Th1. Por otro lado, se sabe que las células T reguladoras (Treg) son capaces de modular ambos tipos de respuestas. Se dispone de datos que hacen pensar que puede existir una regulación epigenética de la activación de las respuestas Th1/Th2 y de las células T reguladoras. La activación y diferenciación de las células T son procesos extraordinariamente complejos; básicamente, se inician mediante la inducción de señales a través del receptor clonotípico de las células T, citocinas y moléculas de co-estimulación. En ese momento se produce la activación de las redes de transmisión de señales al núcleo, donde se producirá la activación de determinados factores de transcripción, que darán lugar a la expresión de las proteínas correspondientes. Para cada tipo de célula T se producirá de modo diferente que ese explicará, sucintamente, a continuación.

El desarrollo de las células Th1 se inicia con la activación del factor de transducción de señales y activador de la transcripción 5 (STAT5) en respuesta al INF-g y a la IL-27. Junto con factores de transcripción inducidos por el TCR, STAT5 induce al factor de transcripción T-bet, que es esencial en la regulación del linaje celular Th1. Este induce a su vez la transcripción de otros factores de transcripción (HLX y RUNX3) y la síntesis de INF-gamma y ejerce un efecto inhibidor sobre GATA-3.

La diferenciación de las células Th2 se inicia por la activación de STAT6 por la IL-4 y por factores de transcripción inducidos por el TCR. Se produce entonces la unión de estas moléculas a GATA-3, que es un factor muy importante en la diferenciación de las células Th2. GATA-3 induce la activación del factor de transcripción MAF, que ayuda a activar IL-4 y que, junto con GATA-3 y STAT-6 activa la transcripción de IL-4 IL-5 e IL-13. GATA-3 también ejerce un efecto de antagonismo sobre la expresión de INF-gamma y la diferenciación Th1.

En la diferenciación de las células Treg es muy importante la activación de FOXP3 (forkhead box P3). A ella se puede llegar a través de la activación de distintas vías de transmisión de señales, a través del TCR, moléculas co-estimuladoras como CD28, el receptor de la IL-2 o el receptor del TGF-beta.

Los factores de transcripción son capaces de transactivar (inducir) o reprimir directamente la expresión de genes. Pueden también ejercer efecto sobre la transcripción a través del reclutamiento de proteínas que modifican la situación epigenética de los genes a los que se unen o bloquear el reclutamiento de estas proteínas. Estas modificaciones epigenéticas pueden persistir en ausencia de los factores epigenéticos que las indujeron. Se ha observado que las células Th2 presentan cambios epigenéticos permisivos en sus histonas, en las regiones promotoras y aumentadoras y en las zonas hipersensibles a las DNAsas de IL-4 IL-5 e IL-13. Parece que GATA-3 es necesaria y aparentemente suficiente, para inducir la mayor parte, si no todas, las modificaciones epigenéticas de las células Th2 especificadas anteriomente. Por el contrario, las células Th1 presentan patrones represivos en esas mismas localizaciones y permisivos en loci como IFN-γ. En las células T reg se ha observado que el locus FOXP3 está también sujeto a un control epigenético.

CONCLUSIONES

Los datos provenientes de estudios recientes sugieren que las exposiciones intrauterinas a diversos factores ambientales (nutrientes, humo del tabaco, productos microbianos y otros) pueden influir en el desarrollo del sistema inmunitario fetal y “programar” la susceptibilidad al asma y a las enfermedades alérgicas en general. Las modificaciones epigenéticas, con el silenciamiento o con la activación de determinados genes pueden desempeñar un papel en este sentido. Por otra parte, las modificaciones epigenéticas podrían, también, determinar el destino final de la célula T, con la peculiaridad de que estos cambios son transmisibles, y condicionar la respuesta Th1 o Th2 de un sujeto respecto a un antígeno. Sería muy interesante poder comprobar si los tratamientos que inducen la aparición de células Treg in vivo, como la inmunoterapia pueden inducir un fenotipo estable de células Treg.

BIBLIOGRAFIA

1. Aberg N, Hesselmar B, Aberg B, Eriksson B. Increase of asthma, allergic rhinitis and eczema in Swedish schoolchildren between 1979 and 1991. Clin Exp Allergy 1995;25(9):815-9.

2. Upton MN, McConnachie A, McSharry C, Hart CL, Smith GD, Gillis CR, Watt GC. Intergenerational 20 year trends in the prevalence of asthma and hay fever in adults: the Midspan family study surveys of parents and offspring. BMJ 2000;321(7253):88-92.

3. Strachan DP. Hay fever, hygiene, and household size. BMJ 1989 November 18;299(6710):1259-60.

4. von Mutius E. Allergies, infections and the hygiene hypothesis--the epidemiological evidence. Immunobiology 2007;212(6):433-9.

5. Bloomfield SF, Stanwell-Smith R, Crevel RW, Pickup J. Too clean, or not too clean: the hygiene hypothesis and home hygiene. Clin Exp Allergy 2006 ;36(4):402-25.

6. Perkin MR. Football position and atopy--both subject to the birth order effect? BMJ 2003;327(7429):1473-4.

7. Weiss ST, Raby BA, Rogers A. Asthma genetics and genomics 2009. Curr Opin Genet Dev 2009;19(3):279-82.

8. Sanz C, Isidoro-Garcia M, Davila I, de Pedro MP, Mendez SA, Padron J, Ruiz-SanFrancisco A, Lorente F. A new PTGDR promoter polymorphism in a population of children with asthma. Pediatr Allergy Immunol 2009;20(2):151-6.

9. Sanz C, Isidoro-Garcia M, Davila I, Moreno E, Laffond E, Avila C, Lorente F. Promoter genetic variants of prostanoid DP receptor (PTGDR) gene in patients with asthma. Allergy 2006;61(5):543-8.

10. Arriba-Mendez S, Sanz C, Isidoro-Garcia M, Pascual M, Avila C, Davila I, Lorente F. Analysis of 927T > C CYSLTR1 and -444A > C LTC4S polymorphisms in children with asthma. Allergol Immunopathol (Madr ) 2008;36(5):259-63.

11. Isidoro-Garcia M, Davila I, Laffond E, Moreno E, Lorente F, Gonzalez-Sarmiento R. Interleukin-4 (IL4) and Interleukin-4 receptor (IL4RA) polymorphisms in asthma: a case control study. Clin Mol Allergy 2005;3:15.:15.

12. Miller RL, Ho Sm. Environmental Epigenetics and Asthma: Current Concepts and Call for Studies. Am J Respir Crit Care Med 2008 March 15;177(6):567-73.

13. Isidoro-Garcia M, vila-Gonzalez I, Pascual de PM, Sanz-Lozano C, Lorente-Toledano F. Interactions between genes and the environment. Epigenetics in allergy. Allergol Immunopathol (Madr ) 2007;35(6):254-8.

14. Pascual M, Davila I, Isidoro-Garcia M, Lorente F. Epigenetic aspects of the allergic diseases. Frontiers in Bioscience. In press 2010.

15. Shaheen SO, Adcock IM. The Developmental Origins of Asthma: Does Epigenetics Hold the Key? Am J Respir Crit Care Med 2009;180(8):690-1.

16. Shaheen SO. Prenatal nutrition and asthma: hope or hype? Thorax 2008;63(6):483-5.

17. Chatzi L, Torrent M, Romieu I, Garcia-Esteban R, Ferrer C, Vioque J, Kogevinas M, Sunyer J. Mediterranean diet in pregnancy is protective for wheeze and atopy in childhood. Thorax 2008;63(6):507-13.

18. Chatzi L, Kogevinas M. Prenatal and childhood Mediterranean diet and the development of asthma and allergies in children. Public Health Nutr 2009;12(9A):1629-34.

19. Shaheen SO, Northstone K, Newson RB, Emmett PM, Sherriff A, Henderson AJ. Dietary patterns in pregnancy and respiratory and atopic outcomes in childhood. Thorax 2009;64(5):411-7.

20. Olsen SF, Osterdal ML, Salvig JD, Mortensen LM, Rytter D, Secher NJ, Henriksen TB. Fish oil intake compared with olive oil intake in late pregnancy and asthma in the offspring: 16 y of registry-based follow-up from a randomized controlled trial. Am J Clin Nutr 2008;88(1):167-75.

21. Krauss-Etschmann S, Hartl D, Rzehak P, Heinrich J, Shadid R, Del CR-T, Campoy C, Pardillo S, Schendel DJ, Decsi T, Demmelmair H, Koletzko BV. Decreased cord blood IL-4, IL-13, and CCR4 and increased TGF-beta levels after fish oil supplementation of pregnant women. J Allergy Clin Immunol 2008;121(2):464-70.

22. Digel W, Lubbert M. DNA methylation disturbances as novel therapeutic target in lung cancer: preclinical and clinical results. Crit Rev Oncol Hematol 2005;55(1):1-11.

23. Li YF, Langholz B, Salam MT, Gilliland FD. Maternal and grandmaternal smoking patterns are associated with early childhood asthma. Chest 2005;127(4):1232-41.

24. Dehlink E, Yen E, Leichtner AM, Hait EJ, Fiebiger E. First evidence of a possible association between gastric acid suppression during pregnancy and childhood asthma: a population-based register study. Clin Exp Allergy 2009;39(2):246-53.

25. Rebordosa C, Kogevinas M, Sorensen HT, Olsen J. Pre-natal exposure to paracetamol and risk of wheezing and asthma in children: a birth cohort study. Int J Epidemiol 2008;37(3):583-90.

26. Tollanes MC, Moster D, Daltveit AK, Irgens LM. Cesarean section and risk of severe childhood asthma: a population-based cohort study. J Pediatr 2008;153(1):112-6.

27. Thavagnanam S, Fleming J, Bromley A, Shields MD, Cardwell CR. A meta-analysis of the association between Caesarean section and childhood asthma. Clin Exp Allergy 2008;38(4):629-33.

28. Bager P, Wohlfahrt J, Westergaard T. Caesarean delivery and risk of atopy and allergic disease: meta-analyses. Clin Exp Allergy 2008;38(4):634-42.

29. Haberg SE, London SJ, Stigum H, Nafstad P, Nystad W. Folic acid supplements in pregnancy and early childhood respiratory health. Arch Dis Child;94(3):180-4.

30. Matsui EC, Matsui W. Higher serum folate levels are associated with a lower risk of atopy and wheeze. J Allergy Clin Immunol 2009;123(6):1253-9.