El asma es una de las enfermedades respiratorias más comunes, considerada como una enfermedad compleja con un importante componente genético ampliamente descrito. Las estrategias de búsqueda de genes relacionados han ido cambiando de acuerdo a la evolución de la tecnología disponible en biología molecular, llevando a la caracterización de numerosas variantes asociadas a la enfermedad. El estudio de genes de citocinas es determinante, debido al importante papel que juegan en la fisiopatología de la enfermedad. El objetivo de este estudio fue determinar la posible asociación de polimorfismos de genes de diferentes citocinas en una población de pacientes asmáticos. Se encontraron diferencias significativas entre controles y pacientes en el análisis de los polimorfismos -1188IL12B, -308 TNFA, 166 IL2, -174 IL6 y nt565 IL6. El análisis de haplotipos mostró diferencias significativas para los haplotipos IL1B 3962/-511 (GG); TNFA -308/-238 (AG y GG); IL2-330/166 (TT); y IL6 -174/nt565 (GG). Estos resultados ponen de manifiesto la importancia del análisis de haplotipos en el estudio del asma, ya que nos permiten detectar mayor número de variantes que podrían conferir riesgo a la enfermedad.

INTRODUCCIÓN

El asma se puede definir como un trastorno inflamatorio crónico de las vías respiratorias en el que intervienen numerosas células y elementos celulares. La inflamación crónica se asocia con hiperreactividad bronquial que lleva a episodios recurrentes de sibilancias, disnea, opresión torácica y tos, principalmente durante la noche o a primeras horas de la mañana. Estos episodios normalmente se encuentran asociados a una obstrucción variable al flujo aéreo, total o parcialmente reversible, ya sea espontáneamente o por la acción de medicamentos [1].

Se estima que en el mundo existen aproximadamente 300 millones de asmáticos. La distribución no es homogénea, de manera que la prevalencia oscila entre 1-18% en los distintos países [2].

En el asma, los factores de riesgo pueden dividirse en los que causan su aparición y los que desencadenan sus síntomas. La aparición del asma se atribuye principalmente a factores individuales, como el componente genético, el sexo o la obesidad, mientras que las crisis y el agravamiento posterior se asocian fundamentalmente a factores ambientales, como la exposición a alérgenos, contaminantes, infecciones o la dieta [3].

EL ASMA COMO ENFERMEDAD GENÉTICA

Hace mucho tiempo que el asma es considerada una enfermedad con una importante base genética. Los primeros estudios que mostraban pruebas de dicha asociación datan de los primeros años del siglo XX [4-7].

Durante la década de los 80 aparecieron los estudios de segregación familiar y de gemelos mono- y dizigóticos [8] que intentaron determinar el patrón de herencia de la enfermedad. Los resultados pusieron de manifiesto que el asma no sigue un típico patrón de herencia mendeliano, sino que se trata de un síndrome multifactorial consecuencia de la interacción compleja entre diversos factores genéticos y ambientales [9]. A partir de la década de los 90 empieza a entenderse el asma como una enfermedad compleja, en la que existen diferentes y muy variados fenotipos caracterizados por complicados mecanismos moleculares, por lo que cabe pensar que muchos genes ejercen su influencia en esta patología.

El desarrollo de la genética molecular ha permitido la identificación de numerosos genes que intervienen en el asma. El abordaje de la búsqueda de estos genes fundamentalmente se ha realizado mediante dos estrategias básicas: los estudios de ligamiento y los estudios de asociación con genes candidatos.

Los estudios de ligamiento se basan en examinar marcadores genéticos distribuidos a lo largo de todo el genoma en familias con individuos enfermos y analizar si alguno de ellos es más frecuente en los pacientes. El descubrimiento de una región de este tipo, generalmente de 20-30 millones de pb, sugiere que algún gen en dicha región estaría actuando como un factor predisponente de la enfermedad, de manera que los genes presentes en esa zona se convertirían en candidatos para un estudio más exhaustivo de su relación con la patología. La ventaja de este tipo de estudios es que permite identificar nuevos genes y rutas implicadas en patologías complejas [10]. Sin embargo, los resultados de este tipo de análisis son enormemente complejos: La mayoría de las regiones cromosómicas ligadas al asma o alguno de sus síntomas presentan múltiples loci candidatos, cada uno de los cuales podría ejercer un pequeño efecto en la susceptibilidad [10]. Un ejemplo es la región 5q31-33, se trata de una región asociada al asma por estudios de ligamiento que han sido reproducidos en numerosas ocasiones [11] y que contiene 14 genes asociados con el asma, la atopia o fenotipos intermedios, como IL4, IL13, CD14 o ADRB2.

Los estudios de asociación de genes candidatos se fundamentan en el análisis de un grupo de genes que codifican proteínas que intervienen en la patogénesis de la enfermedad. Se basan en la comparación de frecuencias alélicas y genotípicas entre grupos de controles y pacientes sin relación de parentesco. Se trata de un método con mayor capacidad para detectar polimorfismos que confieran un riesgo moderado de enfermar que los estudios de ligamiento [12]. Un problema de los estudios de asociación casos-controles deriva de la posible estratificación de las poblaciones, que podría resultar en diferencias en las frecuencias alélicas entre casos y controles que no se debieran a la enfermedad [10]. Esto se resuelve utilizando métodos estadísticos que permiten detectar y corregir desviaciones poblacionales [11].

Más recientemente, los avances a gran escala de la genómica han hecho que se desarrolle una nueva estrategia para abordar el estudio de las enfermedades complejas. Se trata de estudios de asociación en genoma completo (GWA: Genome Wide Association analysis), en los que se analizan cientos de miles de polimorfismos repartidos por todo el genoma en busca de las variantes que se asocien a la susceptibilidad de padecer una determinada enfermedad compleja o alguno de sus síntomas. Éste tipo de estudios es posible gracias a que actualmente se comercializan micromatrices (microarrays) que permiten genotipar un gran número de SNP en miles de pacientes y controles con un coste asumible [13]. Las ventajas de este tipo de estudios son evidentes, ya que permitirán conocer genes candidatos asociados a un riesgo moderado [12]. Sin embargo, como con cualquier nuevo método de análisis, es importante no sobreestimar la capacidad de los estudios de todo el genoma. En primer lugar, hay que ser muy cuidadoso en la selección de la población que se va a estudiar: es necesario que los pacientes estén uniformemente caracterizados, con criterios clínicos que no presenten ambigüedad En segundo lugar, para obtener un poder estadístico aceptable, que permita identificar los alelos de interés, es necesario contar con muestras de gran tamaño y herramientas estadísticas que permitan procesar esa enorme cantidad de datos. La necesidad de trabajar con muestras tan grandes, independientemente de su buena caracterización, puede llevar a una enorme heterogenicidad en las influencias ambientales, muy importantes en el desarrollo de enfermedades complejas como el asma [14]. Otra desventaja que presentan los GWA, común a los estudios presentados en este texto, es que muchos de los resultados que se obtienen no han podido ser reproducidos, por lo que deben ser tomados con precaución. El desarrollo de este tipo de estudios ha supuesto una revolución en el estudio de las enfermedades complejas, sin embargo, los resultados obtenidos hasta ahora no han sido tan relevantes como se esperaba, ya que en la mayoría de ellos se encuentran asociaciones que ya se conocían [15].

OBJETIVOS

El objetivo de este estudio es caracterizar un amplio grupo de polimorfismos de citocinas relacionadas con el asma (IL 1Α, IL 1Β, IL 1R, IL RA, IL 4RΑ, IL 12, IFN G, TGF Β1, TNF Α, IL 2, IL 4, IL 6, IL 10) en una muestra de pacientes asmáticos Además de analizar los polimorfismos individualmente, se determinarán las posibles interacciones génicas así como los haplotipos y diplotipos para aquellos polimorfismos localizados en el mismo gen o, en su caso, cromosoma; con el fin de identificar las variantes génicas que pudieran influir en el fenotipo asmático. Los resultados permitirán determinar la posible influencia de las variaciones en estos genes sobre la evolución de los procesos alérgicos de los pacientes analizados, lo que, a la larga, podría redundar en una mejora en la calidad del manejo clínico de dichos pacientes.

MATERIAL Y MÉTODOS

Se analizaron un total de 376 individuos, que previamente otorgaron su consentimiento informado de acuerdo con el Comité de Ética del Complejo Asistencial Universitario de Salamanca.

• Casos: Se estudiaron 219 pacientes con edad superior a 14 años y diagnóstico clínico de asma.

• Controles: Se estudiaron 157 individuos que cumplían los siguientes criterios: (i) ausencia de historia clínica compatible con asma, alergia o síntomas de enfermedades respiratorias; (ii) ausencia de antecedentes familiares de enfermedades alérgicas o asma.

En todos los pacientes se recogieron las siguientes variables: edad, sexo, antecedentes familiares y personales de enfermedades alérgicas, niveles de IgE total y resultado de las pruebas cutáneas intraepidérmicas con una batería de aeroalérgenos comunes [16].

Estudio Molecular

El ADN se obtuvo a partir de sangre periférica mediante el sistema MagnNA Pure Compact (ROCHEâ, Mannheim, Alemania). Posteriormente se procedió a la amplificación mediante el uso del “Cytokine Genotyping Kit” (InvitrogenTM, Heidelberg, Alemania) la técnica de SSP-PCR (sequence-specific primer-polymerase chain reaction) en la que un conjunto de cebadores permiten amplificar selectivamente los alelos de interés. Tras la amplificación por PCR se procedió a la visualización mediante electroforesis en gel de agarosa al 2% y el genotipo se interpretó según las indicaciones del fabricante.

Análisis de los datos

Se analizaron descriptivamente todas las variables estudiadas para la caracterización de la muestra seleccionada. Se estimó el Equilibrio de Hardy Weinberg para todos los polimorfismos, tanto en el grupo de pacientes como en el de controles. Se determinaron las frecuencias alélicas y genotípicas de los polimorfismos analizados y su comparación con las frecuencias alélicas y genotípicas descritas para ese polimorfismo en otras poblaciones empleando las bases disponibles (HapMap, NCBI). La comparación de la distribución de las variables categóricas se realizó aplicando la prueba de χ2 , prueba exacta de Fisher, prueba de Monte Carlo con 104 simulaciones y OR. Para el estudio de haplotipos se emplearon los algoritmos (Clark´s, EM y Pseudo Gibbs) en los cálculos probabilísticos de combinaciones haplotípicas. El control de los estudios estadísticos se realizó analizando la potencia estadística, el análisis del error tipo I, aplicación de Bonferroni en su caso y mediante los cálculos de probabilidad de emitir resultados falsos positivos en el estudio (FPRP). Estos estudios estadísticos se realizaron empleando distintos programas bioinformáticos: SPSS versión 17.0. (Chicago, Illinois, USA), SHEsis http://www.nhgg.org/ (Shi YY, He L, 2005), Plataforma FPRP para calcular la probabilidad de obtener resultados que sean falsos positivos (Wacholder et al, 2004), Johnp Statistical Methods for Rates and Proportions (Fleiss et al., 1981).

RESULTADOS

La media de edad del grupo control fue de 49,46 años (S.D.= 19,07) con predominio del sexo femenino (63,06%) y unos niveles medios de IgE de 91,56 kU/L (SD: 175,4). Las características de los pacientes se muestran en la tabla 1.

En todos los individuos se valoró la gravedad del asma según los criterios de la clasificación GINA [1], encontrándose una distribución en las diferentes categorías que se muestra en la Figura 1. Con respecto a los antecedentes familiares, un 40,2% de los pacientes refirieron antecedentes familiares de asma y un 42% de atopia. Los resultados de la comparación de frecuencias alélicas y genotípicas entre controles y pacientes se resumen en la Tabla 2 y Tabla 3.

El análisis de haplotipos mostró resultados significativos para los genes IL-1B, TNF-A, IL-2 e IL-6. Los resultados del análisis se muestran en la tabla 4.

DISCUSIÓN

La IL-12 es una citocina proinflamatoria que actúa como inductor esencial en el desarrollo de la respuesta Th1, induciendo un aumento en los niveles de IFN-g y suprimiendo, de este modo, la respuesta Th2. Existen varios estudios que muestran la posible influencia de polimorfismos en su región promotora que podrían ser responsables de alteraciones en sus niveles de expresión. Morahan y col.[17], en una cohorte de niños asmáticos, sostienen que la presencia de un polimorfismo en el promotor de IL12B en heterocigosis se asocia a niveles disminuidos de IL-12, además de a una mayor gravedad de la enfermedad. Esta asociación ha sido reproducida en otros estudios [18, 19], aunque los resultados fueron discordantes en el estudio de Siew-Kim y col. [20], en los que no se encontró relación con el asma ni con los niveles de IL-12, aunque sí con los niveles de IgE. En este sentido, nuestro estudio se encuentra en concordancia con los resultados de Morahan y col., ya que encontramos una frecuencia significativamente superior del genotipo AC en pacientes, además de una mayor frecuencia del alelo mutado en pacientes.

El factor de necrosis tumoral α es una citocina proinflamatoria cuya expresión se encuentra aumentada en pacientes asmáticos. Se ha asociado la presencia del alelo A en el polimorfismo en posición -308 de la región promotora con un aumento en los niveles de esta citocina, presentes en individuos asmáticos: En un artículo publicado en 2005, Randolph y col.[21] hacen una revisión en la que se resumen los estudios que han analizado este polimorfismo en poblaciones con asma y/o alergia, describiendo mayoritariamente una asociación del alelo A y el asma. Éstos resultados han sido corroborados en nuestra población, en la que además hemos encontrado una asociación de los haplotipos AG y GG de las posiciones -308/-238 del gen con la enfermedad. Éstos haplotipos habían sido previamente estudiada por Mahdaviani y col.[22], sin encontrar diferencias estadísticamente significativas. En nuestro caso, detectamos que la presencia del haplotipo AG conferiría mayor riesgo de padecer asma, al contrario que el GG, al que se podría considerar protector. Sería necesario evaluar, aumentando la muestra, si las diferencias encontradas en nuestro estudio se deben a la proximidad de ambos loci y por tanto son consecuencia del efecto del polimorfismo -308, o si por el contrario se deben a un riesgo aditivo del polimorfismo -238, cuyas frecuencias alélicas y genotípicas no muestran diferencias.

Por su parte, la principal función de la IL-2 es estimular el crecimiento y proliferación de los linfocitos T y otras células inmunitarias, además de inducir la síntesis de otras citocinas y moléculas pro-inflamatorias. El polimorfismo IL-2 -330 ha sido estudiado en pacientes alérgicos, poniendo de manifiesto el efecto de la presencia del alelo T en la expresión de esta citocina[23]. Christensen y col. han asociado la presencia del alelo T a niveles disminuidos de IL-2, postulando un desequilibrio en la respuesta inmune que tiene como consecuencia una mayor producción de citocinas pro-Th2, y el desarrollo de enfermedades alérgicas. Al igual que otros autores [24, 25], no encontramos asociación del polimorfismo -330, pero a diferencia de ellos, hemos obtenido resultados significativos en el análisis del polimorfismo 166, no descritos previamente. Además, también encontramos asociación con el haplotipo -330/116, por lo que pensamos que el efecto de la combinación de estos polimorfismos podría ser importante en el desarrollo de la patología.

Existen estudios que proponen que determinados polimorfismos presentes en la región promotora del gen de IL-6 influyen en los niveles de expresión de esta citocina [26], con el consecuente efecto sobre las respuestas inmunológicas mediadas por ésta. La presencia del alelo -174/C se ha asociado a niveles disminuidos de IL-6 en controles [27, 28]. Se ha postulado que la presencia de este polimorfismo produciría una desregulación de los efectos de esta citocina, que tendría como consecuencia una disminución de la respuesta inflamatoria Th2. Nuestra población de asmáticos presenta una menor frecuencia del alelo C en posición -174 que los controles, lo que puede indicar que la presencia de la mutación podría ejercer un efecto protector en los controles, quizás debido a una disminución en la producción de IL-2.

CONCLUSIONES

El estudio de polimorfismos genéticos en pacientes con asma ha permitido asociar gran cantidad de genes a esta patología. En este sentido, el estudio de genes de citocinas es determinante, debido al importante papel que juega en la fisiopatología de la enfermedad. El análisis de haplotipos es fundamental, ya que nos ha permitido detectar influencias génicas que con el estudio de frecuencias alélicas y genotípicas no pudieron ser detectadas. Éstos resultados indican la necesidad de hacer estudios más exhaustivos para evaluar la posible relación entre las variantes génicas significativas detectadas y fenotipos más concretos de asma, así como detectar las posibles interacciones génicas entre los polimorfismos incluidos en el estudio.

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