Introducción

La filagrina es una proteína clave en la diferenciación de la epidermis y en la formación del estrato córneo de la piel. La principal función de este estrato es constituir la capa más externa de la piel que previene de la pérdida de agua y protege de alérgenos y agentes infecciosos.

Es una proteína de 324 aminoácidos y 37kDa de peso molecular. Corresponde al 6% del contenido proteico de la epidermis. Su función es ayudar a la unión de los filamentos de queratina (ver figura 1) y de ahí viene su nombre en inglés filaggrin (FILament AGGregation proteIN).

Se han llevado a cabo diversos estudios en individuos sanos para demostrar la presencia de filagrina en otros tejidos distintos al de la piel y se ha descubierto que no se expresa en la mucosa bronquial(2), nasal(3) o esofágica(3) pero sí lo hace en la mucosa oral(3).

Está codificada por el gen FLG, que se sitúa en el cromosoma 1q21, en una región que se ha denominado EDC (Epidermal Differentiation Complex) ya que en ella se encuentran otras proteínas de la piel como la loricrina, S100A, involucrina, etc. El producto inicial de este gen es la profilagrina, que es una proteína de 400 kDa que está compuesta de 10-12 repeticiones de filagrina (dependiendo de la población). La profilagrina está contenida en los gránulos queratohialinos y se excreta durante el proceso de diferenciación de las células epiteliales. Posteriormente es desfosforilada y lisada para dar lugar a la filagrina.

El gen FLG está compuesto por tres exones(4):

• Exón 1: Secuencias 5’UTR (15 pb).

• Exón 2: Contiene el codón de iniciación (159 pb).

• Exón 3: Codifica la mayor parte del dominio N-terminal y la profilagrina (12753 pb).

Smith et al(5) describió la asociación entre la Ictiosis Vulgar y dos mutaciones localizadas en el exón 3 del gen FLG: R501X (transición de una citosina por una tiamina) y 2282del4 (deleción de 4 nucleótidos). Ambas mutaciones son null-mutations y producen una proteína profilagrina truncada y por lo tanto que no se expresará filagrina en el estrato córneo.

Posteriormente se evaluó la presencia de estas mutaciones en otras enfermedades en las que existe una alteración de la queratinización, como la dermatitis atópica. Se ha descrito que el hecho de presentar estas mutaciones predispone a padecer dermatitis atópica en población escocesa, irlandesa y danesa(6) y más adelante en otros estudios llevados a cabo en otras poblaciones. Recientemente dos meta-análisis(7, 8) han llegado a la conclusión de que estas mutaciones predisponen a padecer dermatitis atópica.

Se ha investigado en varios estudios la relación de estas mutaciones con la rinitis alérgica y van den Oord et al(7) en su meta-análisis llega a la conclusión que estas mutaciones predisponen a padecer rinitis alérgica. Analizan por separado los pacientes que padecen dermatitis atópica de los que no para evitar que esté pueda ser un factor de confusión:

• Pacientes con rinitis alérgica que no padezcan eczema o dermatitis atópica: casos y controles OR 1,78 (IC95%: 1,16-2,73).

• Pacientes con rinitis alérgica que padecen eczema o dermatitis atópica: casos y controles OR 2,84 (IC95%: 2,08-3,88) y estudios de familias OR 2,46 (IC95%: 1,61-3,76).

Por último se ha intentado relacionar en diversos estudios estas mutaciones con el asma. Los anteriores meta-análisis(7, 8) analizan todos los estudios hasta la fecha y separan también los pacientes que padecen dermatitis atópica de los que no para evitar que esté pueda ser un factor de confusión. En la tabla 1 se puede ver que llegan a la conclusión de que existen diferencias significativas en los pacientes que padecen asma asociado a eczema o dermatitis atópica, pero no en los pacientes asmáticos que no padecen estas enfermedades dermatológicas.

Rodriguez et al(8) analiza también la influencia de estas mutaciones en el asma independientemente de padecer o no eczema o dermatitis atópica y encuentra que existen diferencias significativas: OR 1.48 (IC95%: 1.32-1.66). Además de las mutaciones R501X y 2282del4 se han descrito otras mutaciones que pueden tener interés en enfermedades alérgicas en un futuro como son R2447X, S3247X, 3702delG, 3673delC (y S2554X, 3321delA, S2889X, S3296X en población japonesa).

Hipótesis de trabajo

Se han llevado a cabo muy pocos estudios en la población española y por ello no se conoce con exactitud si los datos obtenidos en otras poblaciones se pueden extrapolar a la nuestra. Además si se corroboran los datos en una nueva población ayudaría a dar validez a la hipótesis de que esas variaciones del gen aumenta la susceptibilidad de padecer asma.

En los estudios genéticos es de vital importancia la selección de la población estudiada. Además resulta esencial la calidad en los procedimientos de laboratorio y un elevado nivel de exigencia de las pruebas estadísticas, para disminuir al máximo la posibilidad de encontrar resultados espurios. Los resultados de este estudio de asociación controlado podrían tener implicaciones desde el punto de vista pronóstico en una enfermedad compleja con una elevada prevalencia como es el asma.

Por estos motivos diseñamos el “Estudio de mutaciones en el gen de la filagrina y su relación con diversos fenotipos de asma” en el que pretendemos estudiar la presencia de las mutaciones R501X y 2282del4 en población española y más concretamente en pacientes asmáticos con dos fenotipos muy diferenciados: asma alérgica y asma intrínseca.

Objetivos

1. Descripción de las características clínico-biológicas de una población de asmáticos alérgicos y no alérgicos evaluados en un Servicio de Alergología.

2. Determinar la frecuencias alélicas y genotípicas de las mutaciones R501X y 2282del4 del gen FLG en nuestra población.

3. Valorar la asociación de los polimorfismos individualmente considerados con los parámetros clínico-biológicos.

4. Establecer las combinaciones haplotípicas y diplotípicas en la población de pacientes asmáticos.

5. Análisis de las posibles asociaciones de los haplotipos y diplotipos con el fenotipo de asma.

6. Identificar combinaciones génicas como posibles factores pronósticos en los pacientes afectados según los distintos fenotipos de asma extrínseca e intrínseca, en nuestra población.

Material y métodos

Diseño del estudio: Estudio observacional, transversal, de casos y controles.

Población estudiada: Se incluirán un total de 400 individuos: 300 pacientes españoles diagnosticados de asma según los criterios de la GINA (Global Initiative for Asthma) que acuden a revisión o resultados a nuestra consulta divididos en dos grupos; y 100 controles:

• Fenotipo Intrínseco: 150 pacientes diagnosticados de asma, con pruebas cutáneas negativas para la batería estándar de aeroalérgenos e historia clínica compatible con asma intrínseca.

• Fenotipo Atópico: 150 pacientes diagnosticados de asma, con pruebas cutáneas positivas para algún aeroalérgeno de la batería estándar e historia clínica compatible con asma extrínseca y en la que concuerde la sensibilización con la sintomatología que presenta el paciente.

• Grupo control: 100 sujetos que no padezcan atopia o asma y que no refieran ni antecedentes personales ni familiares de asma o atopia.

Se realizará una extracción de sangre para realizar las determinaciones analíticas así como para la obtención de ADN para el correspondiente genotipado. Serán excluidos aquellos pacientes que estén diagnosticados de alguna enfermedad de origen genético.

Los pacientes firmarán un consentimiento informado aprobado por el IACS (Instituto Aragonés de Ciencias de la Salud), donde se explica detalladamente en qué consiste el estudio.

El estudio se ha llevado a cabo entre el Servicio de Alergia del Hospital Clínico Universitario de Zaragoza y el Servicio de Inmunoalergia del Hospital Clínico Universitario de Salamanca.

Variables analizadas:

1. Antecedentes familiares de atopia.

2. Antecedentes personales de dermatitis atópica, dermatitis de contacto, alergia alimentaria, alergia medicamentosa, idiosincrasia a AINE, psoriasis o ictiosis vulgar.

3. Presencia de Rinitis Alérgica y valoración de su intensidad según la guía ARIA (Allergic Rhinitis and its Impact on Asthma).

4. Presencia de Rinosinusitis Crónica y valoración de su intensidad según la guía EPOS (European Position Paper on Rhinosinusitis and Nasal Polyps).

5. Antecendentes personales de poliposis nasal y/o anosmia.

6. Valores de la espirometría forzada y de la prueba broncodilatadora.

7. Valor de Óxido Nítrico Exhalado.

8. Antecedentes personales de asma ocupacional o asma empeorada en el puesto de trabajo.

9. Resultado de las pruebas intraepidérmicas (prick) con la batería estándar de aeroalérgenos (Phleum, Cynodon, olivo, parietaria, Chenopodium, Salsola, plátano de sombra, ciprés, Alternaria spp, Cladosporium spp, Aspergillus spp, D. pteronyssinus, Tyrophagus putrescentiae, Lepydoglyphus destructor, epitelio de perro, epitelio de gato).

10. Valor de IgE total.

11. Gravedad del asma según la GINA (Global Initiative for Asthma).

12. Escalón de tratamiento actual según la GINA.

13. Resultado del cuestionario de calidad de vida miniAQLQ (miniAsthma Quality of Life Questionnaire).

14. Resultado del cuestionario de control del asma ACT (Asthma Control Test).

Genotipado: Para el análisis de las mutaciones objeto de estudio, se obtendrá ADN genómico a partir de sangre total de cada uno de los individuos, utilizando un procedimiento estándar mediante un sistema de extracción de ADN comercial (Maxwell 16 de Promega).

A partir del ADN genómico, se amplificarán mediante la técnica de PCR un fragmento de 1.102pb que flanqueen las regiones de interés del gen FLG. La determinación de estas mutaciones se realizará empleando dos métodos:

• Estudio de secuenciación para la mutación R501X. El estudio de secuenciación permitirá analizar esta región y detectar posibles nuevos SNP. En la figura 2a se puede apreciar un individuo que no presenta mutación en ninguno de los dos alelos (presenta una citosina en cada alelo) y en la figura 2b un individuo heterocigoto para la mutación (presenta un alelo sin mutar con una citosina y el otro mutado con una una tiamina). En el estudio preliminar no hemos encontrado sujetos homocigotos para la mutación R501X (se visualizaría como una tiamina debido a que los dos alelos presentan la mutación).

 • Estudio de RFLP mediante la enzima de restricción para la mutación 2282del4 que crea una nueva diana de restricción para la enzima DraIII. La separación de los fragmentos de PCR digeridos mediante electroforesis en gel de agarosa, permitirá la visualización inmediata. Si existe la deleción de 4 aminoácidos obtendremos un fragmento de 962pb y otro de 136pb. En la figura 3 se puede apreciar la visualización de un (a)sujeto sin las mutaciones (presenta una banda de 1.102pb que corresponde al fragmento de PCR en el que no actúa DraIII) y (b)heterocigoto para la mutación 2282del4 (presenta una banda de 1.102pb correspondiente al alelo sin mutar; una de 962pb y 136pb correspondientes al alelo mutado en el que sí actúa DraIII). En el estudio preliminar no hemos encontrado sujetos homocigotos para la mutación R501X (se visualizarían una banda de 962pb y otra de 136pb porque la enzima actúa en los dos alelos).

Resultados Nuestra muestra estaba compuesta por sujetos con una edad media de 47,9±17,9años y el 40,5% eran hombres. Existen diferencias significativas entre los 3 grupos. (tabla 2).

Si analizamos los antecedentes familiares de atopia vemos que existen diferencias significativas entre grupos. También observamos diferencias significativas en los antecedentes personales de dermatitis atópica, alergia alimentaria, alergia a fármacos, idiosincrasia a AINE. No existen diferencias significativas al analizar antecedentes personales de dermatitis de contacto, psoriasis o ictiosis vulgar. (tabla 3).

El 86,7% de los sujetos padecen rinitis (93,3% en el grupo atópico y 80,8% en el grupo intrínseco, con diferencias significativas entre grupos). Si analizamos las gravedades de la rinitis podemos observar: • En el grupo atópico la clasificación ARIA muestra 16,3% rinitis alérgica intermitente y 83,7% persistente. La gravedad es 19,1% leve y 80,9% moderada-severa.

• En el grupo intrínseco 52,0% de los pacientes presentaban rinosinusitis crónica, siendo su gravedad según la guía EPOS 67,9% leve, 23,1% moderada y 9,0% grave. El 17,0% de los pacientes presentan poliposis nasal (6,0% en los atópico y 28,0% en los intrínsecos, con diferencias significativas entre grupos) y 12,3% anosmia (8,0% en los atópicos y 16,7% en los intrínseco, con diferencias significativas entre grupos). Existen diferencias significativas al analizar FVC, FEV1, FEV1/FVC y valor de óxido nítrico exhalado. (tabla 4). Un 5,3% de los pacientes presentaban asma empeorado en el puesto de trabajo (sin diferencias significativas entre grupos).

En el grupo atópico las pruebas cutáneas fueron positivas en 21,3% para alérgenos estacionales (pólenes), 15,3% para alérgenos perennes (ácaros, hongos, epitelios) y 65,3% para alérgenos estacionales perennes. El valor medio de IgE total es 189,6 ±384,6IU/mL (379,8 ±535,8 en atópicos, 68,6 ±117,7 en intrínseco y 86,0 ±235,2 en grupo control, con diferencias significativas entre grupos). Al analizar la severidad y el escalón de tratamiento según la GINA vemos que existen diferencias significativas entre grupos. (tabla 5).

La puntuación media en el cuestionario de calidad de vida miniAQLQ es de 6,1 ±0,8 (6,1 ±0,7 en atópicos y 6,1 ±0,9 en intrínsecos, sin diferencias significativas entre grupos) y del cuestionario de control de asma ACT 21,6 ±4,3 (21,6 ±3,8 en atópicos y 21,5 ±4,9 en intrínsecos, sin diferencias significativas entre grupos). Actualmente estamos en la fase de análisis estadístico de las mutaciones R501X y 2282del4 y su influencia en las distintas variables del estudio.

Discusión

Las mutaciones del gen de la filagrina han demostrado gran importancia en la ictiosis vulgar y en la dermatitis atópica, pero todavía no está clara su relación con el asma. Probablemente el efecto encontrado en varios estudios se deba a la influencia del eczema o dermatitis atópica en los sujetos que tienen asma asociado a estas enfermedades dermatológicas.

Presentamos los datos preliminares de un estudio llevado a cabo en población española analizando la presencia de las mutaciones R501X y 2282del4 del gen FLG que codifica para la filagrina.

Hemos incluido en el estudio dos grupos de pacientes asmáticos con fenotipo bien diferenciado y que presentan características muy diferentes. El objetivo de esto es tratar de averiguar si la influencia de las mutaciones en el gen de la filagrina están más relacionadas con la atopia o con la presencia de otras enfermedades, que con el hecho de padecer asma.

Bibliografía

1. Candi E, Schmidt R, Melino G. The cornified envelope: a model of cell death in the skin. Nat Rev Mol Cell Biol2005 Apr;6(4):328-40.

2. Ying S, Meng Q, Corrigan CJ, Lee TH. Lack of filaggrin expression in the human bronchial mucosa. J Allergy Clin Immunol2006 Dec;118(6):1386-8.

3. De Benedetto A, Qualia CM, Baroody FM, Beck LA. Filaggrin expression in oral, nasal, and esophageal mucosa. J Invest Dermatol2008 Jun;128(6):1594-7.

4. Presland RB, Haydock PV, Fleckman P, Nirunsuksiri W, Dale BA. Characterization of the human epidermal profilaggrin gene. Genomic organization and identification of an S-100-like calcium binding domain at the amino terminus. J Biol Chem1992 Nov 25;267(33):23772-81.

5. Smith FJ, Irvine AD, Terron-Kwiatkowski A, Sandilands A, Campbell LE, Zhao Y, et al. Loss-of-function mutations in the gene encoding filaggrin cause ichthyosis vulgaris. Nat Genet2006 Mar;38(3):337-42.

6. Palmer CN, Irvine AD, Terron-Kwiatkowski A, Zhao Y, Liao H, Lee SP, et al. Common loss-of-function variants of the epidermal barrier protein filaggrin are a major predisposing factor for atopic dermatitis. Nat Genet2006 Apr;38(4):441-6.

7. van den Oord RA, Sheikh A. Filaggrin gene defects and risk of developing allergic sensitisation and allergic disorders: systematic review and meta-analysis. BMJ2009;339:b2433.

8. Rodriguez E, Baurecht H, Herberich E, Wagenpfeil S, Brown SJ, Cordell HJ, et al. Meta-analysis of filaggrin polymorphisms in eczema and asthma: robust risk factors in atopic disease. J Allergy Clin Immunol2009 Jun;123(6):1361-70 e7.