Generalidades

Desde la puesta a punto de proyectos de gran envergadura como los que rodearon el descifrado el genoma humano, el desarrollo de nuevas tecnologías aplicadas al estudio de los seres vivos ha crecido significativamente en los últimos años. Este desarrollo se multiplicó aún más cuando se comprendió que el resultado de conocer el genoma no era más que el primer paso para empezar a estudiar realmente cual era el significado de este.

En el año 1994 surgió el término proteoma para definir a todas las proteínas que eran expresadas por un genoma en un tejido o en una célula . Hoy en día, el concepto de proteómica se aplica a la ciencia que correlaciona las proteínas sintetizadas a partir de genes y por lo tanto, ha ido introduciéndose poco a poco en el campo de la Alergia al ser las proteínas/alergenos los responsables directos de la respuesta alérgica. (Figura 1).

Dentro del concepto proteómica, pueden establecerse dos categorías:

• Proteómica de expresión: Se refiere a la descripción del proteoma de un organismo para identificar las proteínas que forman parte de él. En el campo que nos ocupa, podríamos hablar de proteómica de expresión cuando se plantea el identificar los componentes proteicos y/o alergénicos de una fuente de alergenos y además determinar o cuantificar su presencia en las estructuras o tejidos donde aparece.

• Proteómica funcional: Este tipo de proteómica va más encaminado a describir las funciones de las proteínas en un tejido y cual es su actividad biológica. Volviendo al tema de la Alergia, podríamos hablar de proteómica funcional cuando se describe el papel biológico de un grupo de proteínas/alergenos y su utilidad en el metabolismo del tejido del que forman parte.

Las técnicas aplicadas a la proteómica se han convertido en una herramienta básica para el estudio de los alergenos implicados en la sensibilización. Se pueden distinguir dos grandes grupos de técnicas:

• Técnicas de separación de muestras biológicas, destinadas a purificar y obtener alergenos aislados: Electroforesis uni (SDS-PAGE) o bi dimensional (2D-PAGE), técnicas cromatográficas como FPLC o HPLC, etc.

• Técnicas de identificación o análisis de proteínas, entre las que la más destacada es la espectrometría de masas, con todas sus variantes. El objetivo de estas técnicas es la identificación de la secuencia y estructura de los alergenos para correlacionarlos con su actividad biológica.

Proteómica y alergenos

Desde que hace ya más de 30 años se purificaran los primeros alergenos y se relacionaran directamente como causantes de sensibilización, la descripción de la estructura proteica (primaria, secundaria, terciaria o cuaternaria) o la función biológica de estos se ha incrementado exponencialmente en los últimos años.

La espectrometría de masas juega un papel fundamental en la identificación de alergenos. Una vez identificada la proteína causante de la sensibilización en los pacientes, es de gran interés el conocimiento de su secuencia de aminoácidos, ya que nos proporcionará información acerca de su función o de las características de esta. Para ello, las proteínas una vez digeridas, se someten a una ionización, la separación de las especies iónicas resultantes se realiza según la relación entre su masa y su carga eléctrica, mediante campos electromagnéticos (Figura 1).

En la actualidad, cientos de alergenos de todas las fuentes alergénicas posibles se han caracterizado y este número se incrementa de forma continua (www.allergen.org o www.allergome.com). Cada día se publican estudios describiendo nuevos alergenos o agrupándolos en función de su estructura o sus características biológicas.

Proteómica y extractos alergénicos

Los extractos alergénicos provienen de sistemas biológicos (granos de polen, ácaros, hongos, etc…) formados por una mezcla compleja de proteínas, algunas de ellas alergenos, y otros compuestos biológicos. Para el estudio de estos componentes proteicos se emplean técnicas de separación como la electroforesis o la cromatografía, que aprovechan las propiedades particulares de las proteínas para su separación y/o purificación. Pero si bien las técnicas de proteómica han contribuido significativamente a la descripción, clasificación y descubrimiento de nuevos alergenos (investigación básica), el empleo de estas técnicas se ha utilizado y utiliza habitualmente para la caracterización e identificación de los extractos alergénicos, con el objetivo de desarrollar extractos para inmunoterapia o para controlar la calidad de estos. El empleo de técnicas de electroforesis como el SDS-PAGE han permitido analizar la composición antigénica de los extractos, o incluso para comparar las modificaciones en el perfil antigénico, por ejemplo, después de procesos de purificación de los extractos, con el objetivo de demostrar que la composición antigénica se mantiene inalterada (Figura 2).

Proteómica e identificación de nuevos alergenos

En otros casos, el uso de técnicas como la electroforesis 2-D, han permitido identificar isoformas de los diferentes alergenos, o incluso nuevos alergenos en especies muy relacionadas, explicando diferentes perfiles de sensibilización en poblaciones.

Un caso recientemente publicado ha sido el hallazgo de isoformas diferentes en extractos alergénicos de especies diferentes pero muy próximas en la escala taxonómica . En este estudio, los autores pusieron de manifiesto que las especies Salsola kali y Salsola oppositifolia (ambas pertenecientes a la familia de las Chenopodiaceas), a pesar de compartir una homología muy elevada en su perfil proteico y un elevado grado de reactividad cruzada entre ellas, eran capaces de sensibilizar a pacientes diferentes. De los 246 pacientes residentes en la costa mediterránea española incluidos en el estudio, el 96.3% presentaban prueba cutánea positiva a S. oppositifolia, mientras que un 76.8% estaban sensibilizados a S. kali. Estas diferencias en el porcentaje de sensibilización llevaron a pensar que entre ambos extractos debían existir variaciones antigénicas significativas, capaces de producir un perfil alergénico diferente de la población. El estudio del perfil proteico undimensional no aportó resultados especialmente significativos ya que no se encontraron diferencias apreciables entre ambos extractos. Sin embargo, al aplicar técnicas más especificas de proteómica como la electroforesis bidimensional, se puso de manifiesto que en S. oppositifolia aparecían una serie de isoalergenos de alrededor de 20 kDa que podían estar relacionados con la sensibilización de estos pacientes (Figura 3). El estudio más detallado de esta región mostraba la presencia de alergenos en un rango de peso molecular entre 14 y 30 kDa y un punto isoeléctrico entre 6.5 y 9 kDa (Figura 4). Aunque en ambos casos el alergeno principal correspondía al grupo 1 de la familia de las Chenopodiaceas (Sal k 1) , los nuevos alergenos de bajo peso molecular parecían tener una reactividad cruzada más específica con los alergenos de la especie de la misma familia, Chenopodium album. Las conclusiones del estudio ponían de manifiesto la importancia alergológica de la especie S. oppositifolia y sugerían la importancia de incluir esta especie en la batería de alergenos a utilizar en el diagnóstico en determinadas zonas o áreas geográficas con presencia de esta.

Proteómica y caracterización de extractos alergénicos

Según la normativa europea, se consideran productos alergénicos a las preparaciones farmaceúticas obtenidas de extractos de materias primas de origen natural que contienen alérgenos. En este grupo se incluyen las vacunas derivadas de extractos alergénicos nativos, modificados (alergoides), productos conjugados de alérgenos con otras sustancias, o productos alergénicos fabricados mediante la tecnología del ADN recombinante (esto es, por clonado de alérgenos y obtención de formas recombinantes). Todos estos productos son, o están en vía de serlo, formas de tratamiento de la enfermedad alérgica. Por ello, la caracterización detallada de cada uno de los componentes de estas vacunas es un requisito indispensable para garantizar la calidad del producto que recibe el paciente.

Algunos de estos tipos de tratamiento están formados por extractos alergénicos nativos cuya composición son los alergenos naturales extraídos directamente de la fuente alergénica. Este tipo de productos fueron los primeros que se desarrollaron y están basados en las primeras vacunas desarrolladas en 1911 por Noon y Freeman. Aunque en la actualidad se ha incorporado la estandarización en algunos de los tratamientos o algún adyuvante en la formulación, son vacunas cuyo proceso de caracterización es muy sencillo.

Sin embargo, en las últimas décadas se han desarrollado vacunas más complejas con el objetivo de poder incrementar las dosis de alergeno que se administra, manteniendo o incrementando así la eficacia, al mismo tiempo que mejoran considerablemente la seguridad del producto. Obviamente, la mayor complejidad de las moléculas supone una mayor complejidad de los sistemas de caracterización y estandarización que tienen que ir asociados al empleo de técnicas mucho más complejas y especializadas. A las técnicas habituales que se emplean en la estandarización y caracterización de los extractos alergénicos, se han unido las nuevas técnicas de proteómica desarrolladas en los últimos años, las cuales están sirviendo como herramientas muy útiles para incrementar la caracterización de los extractos alergénicos. Uno de estos ejemplos son los alergoides, moléculas de elevado peso molecular formadas tras la polimerización de los alergenos individuales procedentes de los extractos alergénicos.

Caracterización de alergoides en base a su tamaño molecular

El proceso de polimerización da lugar a complejos de alergenos de peso molecular de miles de Kilodaltons, difíciles de determinar. El empleo de técnicas de alta resolución como el HPLC ha permitido estimar los tamaños moleculares de estos extractos y determinar el grado de consistencia de los productos obtenidos.

Hasta el momento, la distribución del tamaño molecular sólo ha sido publicada en extractos Depigoid®. Mediante cromatografía de alta resolución de exclusión molecular se ha podido determinar el tamaño de los complejos alergénicos que se forman después de la despigmentación y polimerización de los alergenos . Esto ha permitido demostrar que este tipo de extractos presentan un elevado grado de consistencia durante el proceso de fabricación, garantizando así que el paciente está recibiendo extractos de composición molecular muy similar en todos los casos (Figura 5).

Determinación de la composición antigénica de los alergoides despigmentados y polimerizados

Una de las principales preguntas que aún surge a la hora de hablar de la composición antigénica o proteica de los alergoides es la composición de los macrocomplejos moleculares y si estos extractos contienen todos los alergenos presentes en los extractos nativos.

Hasta el momento, esta pregunta crucial en la caracterización de los alergoides está únicamente aclarada en extractos Depigoid®, al demostrarse mediante espectrometría de masas, que extractos despigmentados-polimerizados de Betula alba, Phleum pratense y Dermatophagoides pteronyssinus, como representantes principales de árboles, gramíneas y ácaros respectivamente, contenían todos los alergenos relevantes (principales y menores) que se identifican en pasos previos a la polimerización.

El mecanismo de identificación se basa en la digestión enzimática de las moléculas despigmentadas. Una vez digeridos los extractos alergénicos se obtenía una mezcla peptídica resultante de la digestión del despigmentado-polimerizado. Los péptidos resultantes se separaban en base a su tamaño molecular y eran analizados e identificados mediante espectrometría de masas. Las secuencias de aminoácidos de los péptidos digeridos se comparaban frente a un banco de datos que contiene todas las secuencias de proteínas descritas (SwissProt databank). Los resultados obtenidos demostraban que las secuencias procedentes de la digestión de los extractos despigmentados-polimerizados, pertenecían a proteínas con secuencia ya conocida y que correspondían con las secuencias de los alergenos procedentes de la fuente alergénica objeto de estudio. En resumen, y según se muestra en la figura 6, en el caso de los extractos despigmentados-polimerizados de abedul, tras el corte con tripsina y pepsina se obtuvieron, respectivamente, 5 y 2 secuencias diferentes que correspondían a diferentes fragmentos de Bet v 1, repitiéndose para 12 isoformas diferentes de Bet v 1. Pero no sólo se identificaba el alergeno principal Bet v 1, sino que también se obtuvieron secuencias de los alergenos descritos en abedul hasta ahora como Bet v 2, Bet v 3, Bet v 4, Bet v 6 y Bet v 7. Resultados similares, identificándose tanto los alergenos principales como menores, se han obtenido en P. pratense y D. pteronyssinus.

Conclusiones

La proteómica aplicada constituye una herramienta eficaz, no sólo para el estudio y descripción de nuevos alergenos, sino también para la caracterización de los extractos alergénicos, permitiendo dar un paso más en el conocimiento y caracterización de los extractos. Debido al potencial que este tipo de técnicas proporcionan, y la información que genera respecto a los componentes básicos de las proteínas, puede convertirse en una herramienta imprescindible para la cuantificación y la caracterización de los extractos. En este último aspecto, la espectrometría de masas puede jugar un papel activo en la identificación de alergenos e isoalergenos que forman parte de los extractos, y en especial de los alergoides, impulsándose definitivamente la estandarización de los extractos.

El empleo de técnicas propias de la proteómica supone un gran esfuerzo a la hora de manejar la gran cantidad de datos complejos que produce. La aplicación de la espectrometría de masas y de cromatografía de alta resolución de exclusión molecular en extractos despigmentados-polimerizados ha hecho, a día de hoy, que estos extractos sean los alergoides, a disposición del tratamiento de los pacientes, mejor caracterizados en el mercado.

Bibliografía

1. Pando V, Ferreira C. Proteómica: hacia el entendimiento del lenguaje de las proteínas. Biotecnología. 2007; 14: 97-108.

2. Mari A. When does a protein become an allergen? Searching for a dynamic definition based on most advanced technology tools. Clin Exp Allergy 2008; 38:1089-1094.

3. Aalberse RC. Structural biology of allergens. J Allergy Clin Immunol. 2000 Aug;106(2):228-38. Review.

4. Lorenz AR, Lüttkopf D, May S, Scheurer S, Vieths S. The principle of homologous groups in regulatory affairs of allergen products--a proposal. Int Arch Allergy Immunol. 2009;148(1):1-17.

5. Ferrer A, Larramendi CH, Huertas AJ, Pagán JA, Andreu C, García-Abujeta JL, López-Matas MA, Carnés J. Allergenic differences among pollens of three Salsola species. Int Arch Allergy Immunol. 2010;151(3):199-206.

6. Carnés J, Fernández-Caldas E, Marina A, Alonso C, Lahoz C, Colás C, Lezaun A. Immunochemical characterization of Russian thistle (Salsola kali) pollen extracts. Purification of the allergen Sal k 1. Allergy. 2003 Nov;58(11):1152-6.

7. Barderas R, García-Sellés J, Salamanca G, Colás C, Barber D, Rodríguez R, Villalba M. A pectin methylesterase as an allergenic marker for the sensitization to Russian thistle (Salsola kali) pollen. Clin Exp Allergy. 2007 Jul;37(7):1111-9.

8. Producta Allergenica. European Pharmacopoeia 6.6. 01/2010:1063.

9. Carnés J, Himly M, Gallego M, Iraola V, Robinson DS, Fernández-Caldas E, Briza P. Detection of allergen composition and in vivo immunogenicity of depigmented allergoids of Betula alba. Clin Exp Allergy. 2009 Mar;39(3):426-34.

10. Himly, M, Carnés J, Fernandez-Caldas E, Briza P, Ferreira F. Characterization of allergoids. Arb Paul Ehrlich Inst Bundesamt Sera Impfstoffe Frankf A M. 2008;(96):61-69; discussion 69, 70.

11. Gallego MT, Iraola V, Himly M, Robinson DS, Badiola C, García-Robaina JC, Briza P, Carnés J. Depigmented and Polymerised House Dust Mite Allergoid: Allergen Content, Induction of IgG4 and Clinical Response. Int Arch Allergy Immunol. 2010 Mar 31;153(1):61-69.

12. Reuter A, Lüttkopf D, Vieths S. New frontiers in allergen standardization. Clin Exp Allergy. 2009 Mar;39(3):307-9.