RESUMEN:

A lo largo del tiempo, un número considerable de genes y regiones cromosómicas se han asociado al asma y la atopia. La complejidad del componente hereditario de esta enfermedad se une a la controversia que se produce en ocasiones entre los numerosos trabajos científicos llevados a cabo en distintas poblaciones y sobre los diferentes fenotipos que presentan los pacientes.
El gen PTGDR, responsable de la transcripción de uno de los receptores de la prostaglandina D2 conocido con este mismo nombre, y, en concreto, determinados polimorfismos localizados en su región promotora, se han asociado con el fenotipo asmático. Sin embargo, dicha asociación genética ha encontrado limitaciones en la transferibilidad y en muchos casos, la replicación de los datos entre las distintas poblaciones estudiadas. En este sentido, los estudios funcionales se presentan con un complemento indispensable para determinar los mecanismos moleculares que controlan la expresión de PTGDR, la cual parece estar ligada a la aparición de la enfermedad asmática. Considerando que son variantes localizadas en el promotor y, teniendo en cuenta el papel regulador de las regiones promotoras sobre la expresión de los genes que preceden, la cuestión más inmediata a resolver es la implicación que pueden tener estos polimorfismos en la unión de factores de transcripción y con ello en la expresión de PTGDR. Su conocimiento nos podría llevar a una intervención sobre los mismos e incluso a la identificación de futuras dianas terapéuticas, lo que redundaría en una mejora en la calidad del manejo clínico de dichos pacientes.

PTGDR EN LA PATOLOGÍA ASMÁTICA El proceso asmático se caracteriza por una inflamación debida a la secreción de diferentes mediadores que promueven la acumulación de células Th2, eosinófilos y basófilos en las vías respiratorias. Entre ellos, la prostaglandina D2 (PGD2) es el metabolito del ácido araquidónico más abundantemente producido en respuesta a alérgenos ambientales [1] y dicha producción se debe principalmente a la activación de los mastocitos [2]. Uno de los receptores de la PGD2 es el receptor prostanoide D (PTGDR) o receptor prostanoide D1 (PTGDR1), el cual pertenece a la superfamilia de receptores asociados a proteínas G heterotriméricas y es codificado por el gen PTGDR localizado en el brazo largo del cromosoma 14 (14q22.1), al que también se hace referencia como DP, DP1, PTGDR1, AS1 o ASTR1.
La interacción de la PGD2 con PTGDR se asocia con la inhibición de la función efectora de linfocitos Th1, células NK y otras células inmunes [3]. A través de la transmisión de señales por este receptor se inhibe la producción de IL-2 e IFN-γ en células T CD4+ y CD8+ [4], y de IL-12 en las células dendríticas [5]. La migración y las funciones de los linfocitos NK, promotores de la respuesta inmune de tipo Th1 también resultan inhibidas vía DP [6]. Por otro lado, a partir de la interacción de la PGD2 con el receptor CRTH2 se promueve el reclutamiento y activación de células Th2, eosinófilos y basófilos [7, 8], así como la producción de citocinas Th2 (IL-4, IL-5 e IL-13) por dichos linfocitos [9]. A través de PTGDR la prostaglandina D2 suprimiría la respuesta Th1 y promovería un entorno favorable para la polarización de las células T a Th2 [10] que, coordinado con la acción de CRTH2, llevaría al estado Th2 dominante característico de la inflamación alérgica [2]. Otras de las funciones atribuidas a PTGDR son la vasodilatación y el aumento de la permeabilidad vascular [11]; la secreción de moco [12], un aumento de la supervivencia de los eosinófilos [13], linfocitos Th2 y mastocitos [14] y la estimulación de las células epiteliales para la producción de la quimiocina derivada de los macrófagos (MDC) [11, 13], que induce el reclutamiento y la activación de linfocitos Th2 [11], y para la síntesis de la propia PGD2, a través de un mecanismo autocrino mediado por DP [2].

Modelos animales
La deleción completa del gen PTGDR en ratones con asma inducida por la sensibilización con ovoalbúmina (OVA) provoca la inhibición de la respuesta inflamatoria en las vías aéreas mediada por este alérgeno [1]. En modelos similares de asma alérgica en ratones y cobayas, los resultados han apuntado hacia esta función pro-inflamatoria de PTGDR, promotora de la repuesta Th2. Del mismo modo, en otras especies animales, como los perros, la administración de PGD2 en las vías respiratorias induce a un marcado reclutamiento de eosinófilos [1] y una reducción transitoria de los eosinófilos circulantes [15, 16].

Asociación génica con el asma
Tras la asociación del gen PTGDR con el asma y la alergia a causa de su localización génica [17, 18] y los resultados observados en modelos animales [1], se realizaron diferentes trabajos de clonación posicional [19] y de asociación entre la patología asmática y determinados polimorfismos presentes en la región promotora y en la región codificante del gen en distintas poblaciones [20-27]. Como producto de estas investigaciones se han detectado determinadas asociaciones entre el fenotipo asmático y los polimorfismos -613C/T, -549T/C, -441C/T, -197T/C y -95G/T, presentes en la región promotora de PTGDR [20, 23, 24, 28]. Sin embargo, en ocasiones, los resultados descritos en una determinada población no han podido ser replicados en otras. Se ha planteado la posibilidad de la existencia de un primer grupo en el cual han sido descritas varias asociaciones de PTGDR con el asma y fenotipos relacionados, y que estaría constituido por caucasianos, africanosamericanos y puertorriqueños, los cuales presentan frecuencias similares de los haplotipos resultantes de la combinación de 3 de estas variantes (-549/-441/-197). Por el contrario, en un segundo grupo formado por asiáticos y mejicanos, con frecuencias similares de estos haplotipos, PTGDR no parece ser un gen candidato de la patología asmática [28, 29]. En definitiva, la controversia en los resultados obtenidos hasta el momento sobre la asociación de los polimorfismos de dicha región promotora y las distintas combinaciones haplotípicas y diplotípicas con el fenotipo asmático plantea la necesidad de estudios funcionales con los que determinar los mecanismos moleculares que controlan la expresión del gen PTGDR, y la implicación que las variantes génicas de dicha región promotora, lo cual parece estar ligado a la aparición de la enfermedad asmática.

Estudios funcionales
Uno de los aspectos que caracteriza a las enfermedades del tracto respiratorio como el asma es el incremento de la expresión de múltiples proteínas inflamatorias como citocinas, moléculas de adhesión celular, enzimas y receptores implicados en el proceso inflamatorio. Por tanto la regulación transcripcional a nivel génico de estas proteínas, a través de la unión de factores de transcripción entre otros mecanismos, podría desempeñar un papel crucial en la fisiopatología y el desarrollo de esta enfermedad [30]. Por otro lado, los polimorfismos asociados con el asma parecen tener ciertas consecuencias más allá de cambios en la secuencia de las proteínas. Sin embargo, no siempre es fácil determinar los mecanismos mediante los cuales las variantes génicas afectan a la expresión celular de un determinado gen en el contexto patológico [13].
En esta línea, y respecto al posible efecto de las variantes de la región promotora de PTGDR, fueron identificadas determinadas combinaciones haplotípicas de los polimorfismos -549T/C, -441C/T y -197T/C con la capacidad de incrementar los niveles de unión de los factores de transcripción y con ello la expresión de este receptor, como los haplotipos CCC y CCT, así como se determinaron otros haplotipos con los efectos contrarios, como TCT, que resultó el menos eficiente a nivel transcripcional [20]. Estos resultados llevaron a plantear que los haplotipos responsables de una mayor expresión de PTGDR se asociarían con un mayor riesgo de padecer asma a raíz de una mayor capacidad de reclutar células Th2 y gracias al mantenimiento de la eosinofilia en las vías aéreas [13].
Del mismo modo, mediante ensayos de retado en gel, una variante de estos conocida como supershift, y ensayos de inmunoprecipitación de cromatina, se describieron distintos cambios en la unión de los factores de transcripción C/EBPβ, y miembros de las familias Sp y GATA a la región promotora de PTGDR en función de la presencia de las variantes -441C>T, -549T>C y -197T>C. Estas proteínas de unión al ADN promueven la transcripción del gen PTGDR, y la alteración de su afinidad por cambios en su región promotora explicaría una menor tasa de transcripción y por tanto de expresión de este receptor [20]. Estos resultados y los obtenidos hasta el momento sobre la presencia de los polimorfismos, las distintas combinaciones haplotípicas y sobre la asociación de los mismos con el fenotipo asmático han sido el punto de partida para el diseño de un estudio funcional de dicha región promotora, con el fin de determinar los mecanismos moleculares que controlan la expresión del gen PTGDR, y que por otro lado parece estar ligada a la enfermedad.

ESTUDIO DE REGULACIÓN TRANSCRIPCIONAL DE PTGDR
El diseño de nuestro estudio funcional parte de la premisa de que el control de la expresión de un gen se lleva a cabo principalmente a través de elementos reguladores en su región promotora. Las variantes localizadas en el promotor de PTGDR se encuentran en sitios de unión de factores transcripcionales, de hecho y como se ha citado anteriormente, se ha descrito la capacidad de alguna de ellas de alterar la unión de estos elementos de control de la transcripción [20].

Ensayos de retardo en gel
Los ensayos de retardo en gel se realizaron para el estudio del papel de las variantes del promotor del gen PTGDR; -613C>T, -549T>C, -441C>T, -197T>C y -95G>T en la unión diferencial de factores de transcripción. Esta metodología se basa en la migración en una electroforesis en gel de poliacrilamida en condiciones no desnaturalizantes de un fragmento de ADN cuando éste forma un complejo con proteínas, circunstancia que retarda dicha migración (figura 1) [31]. El estudio de cada una de estas variantes génicas, requirió la síntesis de dos fragmentos de ADN de doble cadena portadores de la secuencia en torno a cada uno de ellas, uno contenía la posición conservada y el otro el polimorfismo en cuestión. Estos fragmentos fueron marcados e hibridados con un extracto de proteínas nucleares procedentes de leucocitos de sangre periférica. A la reacción de unión se añadió un competidor inespecífico de ADN, así como con el fin de confirmar la especificidad de las interacciones entre el ADN y las proteínas, se empleó un competidor específico que era el propio fragmento de ADN sin marcar y a una concentración 25 veces superior. De esta manera, cada ensayo de retardo comprendió 3 reacciones (figura 1). La primera con el fragmento de ADN marcado, la segunda con el fragmento marcado y el extracto proteico y la tercera con fragmento marcado, el extracto proteico y el competidor específico. Las diferencias y similitudes entre ellas permitieron la detección de las uniones específicas entre los fragmentos de ADN estudiados y la proteína o proteínas nucleares contenidas en el extracto. Así mismo se utilizaron un control negativo y otro positivo con un fragmento portador de la secuencia de unión del factor Oct2A y esta misma proteína. A partir de estos ensayos, observamos cambios en los patrones de unión de las proteínas nucleares a la región promotora de PTGDR, principalmente a nivel del polimorfismo - 613C>T. Resultados especialmente interesantes, dado que hasta la fecha no habían sido descritos para esta variante y teniendo en cuenta la asociación que este polimorfismo ha presentado con el fenotipo atópico a partir de los estudios de casos y controles realizado por este mismo grupo. Sin embargo, a diferencia del trabajo de Oguma respecto a este mismo tipo de ensayos en torno a los polimorfismos -549T>C, -441C>T, -197T>C [20], no se observaron cambios tan evidentes en los patrones de unión. Es importante remarcar que los resultados obtenidos son en parte dependientes del conjunto de las condiciones del ensayo, sin olvidar el origen de la muestra proteica, de ahí la necesidad de determinar la composición proteica de estos complejos ADN:proteína en cada una de las variantes estudiadas.

Análisis in silico
Un segundo abordaje para el estudio de las variantes del promotor del gen PTGDR; -613C>T, -549T>C, -441C>T, -197T>C y -95G>T se realizó a través del análisis in silico de los sitios de unión a factores de transcripción en dicha región mediante los programas de ElDorado (Genomatix Software GmbH, http://www.genomatix.de/en/index.html) y Transcription Element Search System (TESS, http://www.pcbi.upenn.edu/tess). En este estudio fueron evaluadas tanto las posiciones conservadas como los polimorfismos con el fin de comparar los resultados obtenidos de estos análisis.
A partir del análisis in silico de la región promotora de PTGDR con ElDorado se han planteado diversos factores de transcripción cuya afinidad de unión se vería alterada en función de las variantes de la región promotora. En el caso de la familia Sp, se describe la interacción de Sp2 con la región en torno al polimorfismo -197T>C, y, tal y como planteaba este grupo, en presencia de timina se describe la unión de una segunda proteína o proteínas no pertenecientes a la familia Sp [20], que según los resultados de ElDorado sería el factor E2F-1, que a su vez interacciona con el factor de transcripción DP1 (tabla 1). Por otro lado, cabe destacar el resultado acerca de la interacción en torno al polimorfismo -549T>C del heterodímero VDR/RXR, formado por el receptor de la vitamina D y el receptor del ácido retinoico, cuya unión al promotor de PTGDR depende de la presencia de timina en dicha posición. El metabolito activo de la vitamina D se caracteriza por modular la respuesta inmune en las enfermedades autoinmunes con componente Th1, inhibiendo dicha respuesta y potenciando la respuesta Th2, tal y como ocurre en la patología asmática. De hecho ya ha sido planteado un posible papel de sistema endocrino de la vitamina D en el desarrollo de la inflamación crónica a expensas de la actividad Th2 en un modelo animal de asma alérgica [32].
Del mismo modo, el ácido retinoico, metabolito activo de la vitamina A, se ha asociado a la modulación del equilibrio entre las respuestas Th1/Th2 en el mismo sentido en que lo hace la vitamina D [33]. Los receptores nucleares RXR, en ausencia de este ligando producen el silenciamiento génico, mientras a partir de la interacción con él se promueve la transcripción. PTGDR podría ser uno de los genes diana de estos receptores nucleares, VDR y RXR, ya que se ha descrito un motivo de unión en su secuencia promotora, y considerando la función que se le atribuye de inhibición sobre los linfocitos Th1 y células dendríticas para la producción de citocinas Th1.
En el análisis de esta región promotora con el segundo algoritmo empleado, TESS, destaca la interacción diferencial del factor C/EBP-α con la región en torno a los polimorfismos -613C/T y -441C/T, por haber sido descrito anteriormente en la producción de eosinófilos en un modelo equino de asma [28, 34]. También Oguma, describe la interacción del factor C/EBPβ en torno a la variante -441C>T en presencia de timina [20], en concordancia con los resultados aportados por el TESS para C/EBPα. Además de plantear la idea de que la activación simultánea de GR (receptor de glucocorticoides) y C/EBP-α explicaría los efectos de los tratamientos con esteroides y β-adrenérgicos frente al asma, como la reducción de los niveles de citocinas inflamatorias [28].

Identificación de los complejos ADN:proteína

• Purificación de proteínas de unión al ADN

Una de las estrategias para la identificación de las proteínas formadoras de complejos con el ADN en los ensayos de retardo fue precisamente a través de las moléculas de ADN que contenían estas secuencias, en concreto de la región en torno a la posición -613C>T de PTGDR. Este proceso se fundamenta en la síntesis de una molécula de ADN que contiene múltiples copias en tándem de la secuencia de interés y que se conoce como concatémero, que después se liga a la superficie de partículas magnéticas. Tras la incubación con el extracto de proteínas; aquellas de unión específica a la secuencia determinada de ADN quedan retenidas y, tras una serie de lavados, la recuperación de las proteínas unidas se lleva a cabo a través de un tampón de elevada fuerza iónica que rompe las interacciones de las proteínas con el ADN. Sin embargo, desafortunadamente estos ensayos no superaron la fase de síntesis de los concatémeros.

• Shift-western blotting

En segundo lugar se realizaron ensayos de shift-western blotting, basados en la detección e identificación de las proteínas de unión al ADN de los complejos ADN:proteína a partir de anticuerpos específicos frente a ellas; prescindiendo del marcaje del ADN y manteniendo las mismas condiciones de unión que en los ensayos de retardo en gel (figura 2). Considerando los resultados en estos y los aportados por el análisis in silico, se seleccionaron dos anticuerpos primarios frente a los factores de transcripción E2F-1 y DP1, susceptibles de presentar una unión diferencial en función de los polimorfismos -613C>T y -197T>C de PTGDR, y un anticuerpo frente a la proteína control (Oct2A). A partir de estos estudios no se detectó la presencia de ninguno de esto dos factores en los complejos ADN:proteína en torno a los 5 polimorfismos de PTGDR estudiados. Como testaje de los anticuerpos y de la muestra proteica que manejábamos se realizó un ensayo de western blotting. A partir de los anticuerpos empleados no fue posible descartar ni confimar la presencia de los factores de transcripción E2F-1 y DP1 en la muestra proteica empleada. En concreto a partir de este ensayo y de los anticuerpos anti-E2F1 y anti- DP1 se determina que ninguno de estos factores estaría en el extracto proteico en una cantidad detectable por esta metodología.

Aislamiento en gel e identificación proteica por MALDI-TOF/TOF
Por último, se llevó a cabo el aislamiento de los complejos ADN:proteína identificados en los ensayos de retardo en gel, reproduciendo las condiciones de unión entre ADN y proteínas, y recortando las bandas en el gel de acrilamida con el fin de purificar a partir de ellas el componente proteico con distintas metodologías. Para ello se diseñaron los experimentos de aislamiento utilizando un gel de poliacrilamida para las dos reacciones de unión de cada polimorfismo del promotor de PTGDR, inicialmente -613C>T y -197T>C. Una de las reacciones se realizó con el fragmento de la región conservada y la otra con el fragmento que contenía la variante. Una vez recortadas las bandas se almacenaron en un tubo eppendorf a 4ºC (figura 3).
El análisis de las proteínas de unión a los fragmentos de ADN en torno a las posiciones -613C>T y -197T>C se realizó en la Unidad de Proteómica de la Universidad Complutense de Madrid (UCM-PCM) perteneciente al Instituto Nacional de Proteómica, ProteoRed mediante espectrometría de masas MALDI-TOF/TOF. Esta metodología consiste en la digestión enzimática de una proteína y en la adquisición del correspondiente espectro de masas de los péptidos resultantes y su comparación con un espectro teórico. La digestión enzimática de las proteínas produce un conjunto de péptidos con masas moleculares características para la proteína digerida, y en este sentido, el espectro de masas de este conjunto de péptidos se cataloga como una huella de la proteína, lo que se conoce como PMF (Peptide Mass Fingerprint) [35].
Del análisis de los fragmentos de gel de poliacrilamida con los complejos ADN:proteína retenidos se obtuvieron unos resultados preliminares en los que se pusieron de manifiesto algunos polipéptidos, orientativos sobre posibles factores de transcripción que puedan estar actuando sobre esta región promotora. En concreto en torno al polimorfismo -613T destaca la presencia de varias proteínas con dedos de Zn2+ (tabla 2).

Conclusiones
El estudio funcional llevado a cabo pone de manifiesto la implicación que estas variantes (-613C>T, -549T>C, -441C>T, -197T>C y -95G>T) pueden tener en la expresión génica de PTGDR, a nivel de cambios en la afinidad de los factores de transcripción por el promotor de este gen, especialmente en torno al polimorfismo -613C>T. En concreto, la caracterización de las proteínas de unión al promotor de PTGDR ha planteado entre otros candidatos al factor E2F-1, los receptores de las vitaminas A y D, C/EBPα y varias proteínas con dedos de Zn2+, que verían alterada su interacción con dicha región en función de la presencia de las variantes génicas de dicha región. Sin embargo es necesario desarrollar nuevos abordajes metodológicos que confirmen su posible implicación en la regulación de la expresión de PTGDR.

AGRADECIMIENTOS
Este trabajo ha sido financiado por los proyectos: GRS224/A/08, GRS205/A/08 y GR255 de la Junta de Castilla y León, Ayudas a la investigación clínica 2010 de Caja de Burgos y FIS PS09/02068 y PI10/01706 del Instituto de Salud Carlos III.

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