RESUMEN
La triptasa es una proteína de la familia de las serin-proteasas. Existen cuatro tipos de triptasas y de cada uno de ellos existen distintas isoformas. Esta proteína se caracterizan por adquirir una estructura tetramérica que se almacena en los gránulos de secreción de mastocitos y basófilos y es liberada en el proceso de exocitosis. Es una de las proteasas principales de estas células, por lo que las funciones que se le atribuyen son aquellas en las que se consideran implicados los mastocitos. En términos generales, se han descrito funciones diversas para la triptasa de modo que se le considera implicada tanto en inflamación como en protección contra la infección. Los genes que codifican estas proteínas se encuentran en regiones del cromosoma 16 donde se conocen determinantes de susceptibilidad al asma, además de encontrarse en regiones con tasas elevadas de recombinación y replicación. Se han descrito numerosos polimorfismos para el gen TPSAB1 de la triptasa que pueden tener repercusiones en la expresión de la proteína o en su conformación, lo que requiere estudios posteriores. Además se ha descrito la existencia de dos alelos, α y β, en equilibrio en dicho gen. La caracterización de los distintos individuos en función de la distribución de dichos alelos podría permitir establecer relaciones con fenotipos atópicos o con los niveles de la proteína en suero. La descripción y conocimiento del gen de la triptasa, de la proteína, de sus mecanismos de expresión y funciones permitiría establecer su importancia como diana para futuras intervenciones terapéuticas.

INTRODUCCIÓN
La triptasa es una proteína perteneciente a la familia de las serin-proteasas relacionadas con la tripsina, de la que se diferencia en su forma, actividad y patrones de expresión. En la década de los 80 se caracterizó el gen que codifica la triptasa y su estructura proteica^{1- 3}. La triptasa es la más numerosa de las endopeptidasas almacenadas en los gránulos de secreción de los basófilos y mastocitos^{4, 5}. La localización cromosómica de los genes se conoce a partir de la amplificación de ADN de células somáticas híbridas de ser humano y hámster, localizándolos en el cromosoma 161. Se han descrito al menos cuatro genes agrupados en el extremo del brazo corto de dicho cromosoma 16, en la posición 16p13.3. Se describe un gen TPSAB1, que presenta los alelos α y βI, un gen TPSB2 que presenta los alelos βII y βIII, un gen TPSG1 para el alelo γ y el gen TPSD1, que hasta el 2002 no se consideraba un gen activo sino un pseudogen.
Se sabe que en esta zona existe una región de entre 1,2 y 2 Mb rica en secuencias repetidas en tándem e invertidas, con un notable nivel de repetición de la secuencia (98% de similitud), lo que ha supuesto una complicación en las estrategias de secuenciación y alineamiento en el proyecto genoma humano⁶. Existen datos sobre la presencia, en las inmediaciones del complejo génico (cluster) de la triptasa de un número inusual de eventos, entre los que se incluyen múltiples fenómenos de recombinación y rotura cromosómica durante la replicación, retraso de síntesis o separación de cromátidas, así como resistencia a la clonación y secuenciación.
Es necesario tener en cuenta la complejidad de estos genes, debida a la similitud existente entre los distintos alelos y a la existencia de regiones polimórficas en las secuencias del gen. En general, se sabe que los polimorfismos de un único nucleótido (SNP) localizados en regiones codificantes modifican la estructura proteica; pueden ser silentes, actuando mediante mecanismos que aún no están del todo definidos, o pueden estar localizados en el promotor, modificando la expresión de la proteína⁷, por lo que las variantes génicas pueden contribuir a las enfermedades complejas como la atopia o el asma⁸. En nuestro grupo se han descrito determinados polimorfismos implicados en la patología alérgica^9-11. El estudio del gen de la triptasa, TPSAB1 ha permitido detectar una variabilidad génica debida a la presencia de nuevos SNP, así como una distribución alélica y genotípica específica en nuestra población.
Estudios previos realizados por nuestro grupo mediante la secuenciación de las regiones exónicas e intrónicas flanqueantes nos han permitido identificar nuevos sitios polimórficos en los genes TPSAB1 y TPSB2 no descritos previamente, detectando una región altamente polimórfica comprendida entre el exón 5 y 6.
Se ha estimado la frecuencia del alelo α y del alelo β asumiendo que ambos se encuentran en equilibrio en el gen TPSAB1¹². El gen que codifica la α-triptasa presenta una deleción de 10-11 pares de bases en el intrón 4 y, además, en el exón 4, una secuencia reconocida por la enzima de restricción EcoRV identificable como RFLP (polimorfismo de la longitud de los fragmentos de restricción). El genotipo determinará la proporción de cada subtipo de triptasa presente en el suero y la cantidad relativa de cada una producida por los mastocitos. Existen individuos que carecen del alelo α, por tanto su genotipo será el denominado “todo β”.(ββββ). Los genes anteriormente mencionados codifican las distintas triptasas, que se caracterizan por adquirir, en términos generales, una estructura tetramérica, que es almacenada en los gránulos de secreción gracias a la existencia de polímeros de alta carga negativa^{13, 14}. Es destacable el hecho de que la α-triptasa, debido al cambio de uno de sus residuos, no posea la capacidad de almacenamiento en los gránulos por lo que se le atribuye una secreción constitutiva¹⁵.
La fisiopatología de los procesos en los que está implicada la triptasa no se conoce con claridad. Se ha descrito su participación en los fenómenos inflamatorios y antiinflamatorios e incluso en el control de la infección mediante el reclutamiento de neutrófilos. Debido a su presencia en los mastocitos y a su participación en las reacciones inflamatorias y de hipersensibilidad inmediata se le atribuye un papel importante en los procesos alérgicos. Se ha descrito que esta proteasa empeora la inflamación en el asma de origen alérgico, facilita la aparición y persistencia del edema local, provoca broncoconstricción e incrementa la masa de músculo liso en dichas vías¹². Estudios recientes sugieren, además, la existencia de determinantes de susceptibilidad al asma en el cromosoma 16, en el que se localiza el gen de la triptasa¹⁶. Por tanto, el estudio de esta proteasa es importante ya que supone una prometedora diana para futuras intervenciones terapéuticas.
Como valor diagnóstico la triptasa es de vital importancia ya que sus valores aumentan después de los episodios graves de anafilaxia o de reacciones anafilactoides. Existen distintas patologías que cursan con triptasa elevada, entre las que cabe destacar la mastocitosis, en parte por ser considerada una enfermedad rara y porque su diferencia con los fenómenos anafilácticos radica en el tipo de triptasa circulante. Si los niveles de β-triptasa madura junto con la triptasa total (en la que se incluye pro-β y pro-α-triptasas) son elevados con respecto a los niveles basales del individuo se puede sospechar un fenómeno anafiláctico, en cambio si los niveles basales de la triptasa en suero son elevados, sería necesario descartar una mastocitosis sistémica.
Además, es importante considerar que, según el genotipo del paciente sea carente o no de α-triptasa, pudiera existir una mayor susceptibilidad a enfermedades alérgicas. Las implicaciones de la triptasa en los procesos alérgicos y en la etiopatogenia del asma son importantes. Por ello, el interés del análisis genético, el estudio de sus polimorfismos así como sus niveles basales y después de una reacción anafiláctica. Será importante también trabajar en el estudio de determinadas diferencias en la secuencia génica que afecten al nivel de expresión de la triptasa y, por consiguiente, puede influir en los procesos alérgicos. El objetivo de este estudio ha sido analizar el gen TPSAB1 en una población española relacionando las características clínico biologícas con la presencia de los distintos alelos.

Material y métodos:

Se han analizado un total de 256 individuos, 124 controles que acudieron al Servicio de Inmunoalergia del Hospital Universitario de Salamanca que dieron su consentimiento informado y que cumplían unos estrictos criterios de selección: edad superior a 18 años, ausencia de síntomas y antecedentes de asma, de enfermedades respiratorias y de alergia; ausencia de antecedentes familiares de primer grado de asma, rinitis alérgica o atopia. Además, presentaban pruebas cutáneas negativas con una batería de aeroalérgenos comunes en nuestro medio. El grupo de paciente considerado incluyó 132 individuos, al igual que el caso anterior mayor de edad, con pruebas cutáneas positivas en una batería de aeroalérgenos comunes y con un diagnóstico médico clínico de asma de origen alérgico.
Para llevar a cabo el análisis del alelo α del gen TPSAB1 para el estudio del SNP 363C>T se realizó mediante las enzimas de restricción propuestas por Soto et al.¹² Para ello se empleó la enzima de restricción EcoRV (10 U/μl, Roche, Penzberg, Germany). Tras la amplificación del fragmento de PCR con los oligonucleótidos sugeridos correspondientes se procedió a la digestión con la enzima y el posterior análisis por medio de una electroforesis en gel de agarosa. El sitio de restricción reconocido por dicha enzima es la timina de la secuencia 5´-GCGGATATCGC-3´; este polimorfismo consiste en la sustitución de la citosina por la timina, de tal manera que, en las secuencias en las que en esa posición se localiza la citosina, la enzima de restricción no corta el fragmento del gen dando lugar a una banda de 1028 pares de bases y por el contrario en los casos en los que se produce la sustitución por la timina se produce el corte del fragmento en dos bandas de tamaño 678 y 350 pb. Posteriormente se analizó la frecuencia obtenida en la población control y en los pacientes atópicos.

Resultados:
Los alelos α y β del gen TPSAB1 poseen una homología del 98% en su secuencia nucleotídica. Su diferencia fundamental radica en que en la región del exón 4 existe un sitio de reconocimiento y corte para la enzima de restricción EcoRV. Este sitio de restricción permite determinar el genotipo de los individuos sometiendo el fragmento amplificado del exón 4 a una digestión mediada por dicha enzima. El análisis de los RFLP mostró una frecuencia global de pacientes portadores del alelo alfa de 0.61. Se observa que más de la mitad de toda la población de estudio presentaba el sitio de restricción.
La distribución de portadores del alelo alfa en el grupo de pacientes con asma fue de 0,30 siendo de 0,32 en el grupo control. No se alcanzaron diferencias estadísticamente significativas en la distribución, si bien la presencia del alelo α fue ligeramente superior en el grupo control.

 

Resultado digestión EcoRV			Total
	Presencia de α	Ausencia de α
Controles	81 (0,63)	43 (0,37)	124
Pacientes	80 (0,61)	52 (0,4)	132
Total	161	95	256

Tabla 1: Distribución de individuos portadores del alelo α en los distintos grupos poblaciones

Se realizaron estudios de asociación para el SNP 363C>T (RFLP para EcoRV) con distintas características clínico-biológicas, los niveles de IgE y los niveles de triptasa. También se analizaron las pruebas cutáneas a distintos aeroalérgenos, epitelios, ácaros, hongos y pólenes.

Tabla 2: Distribución de portadores del alelo alfa en función de las pruebas cutáneas a aeroalérgenos

No se observó asociación estadísticamente significativa entre la presencia del alelo alfa y las características analizadas, si bien se observaron unos niveles de triptasa inferiores en los pacientes que portaban el alelo α: 4,77 μg/l frente a 6,15 μg/l en los no portadores (p=0,057).
Discusión:
En este estudio hemos analizado el gen TPSAB1 en una población española.Es importan destacar que el análisis de los alelos α, β descrito por Soto y cols¹² sólo permite inferir la presencia del alelo α pero no permite identificar si la presencia de dicho alelo se establece en homocigosis o heterocigosis. Teniendo en cuenta únicamente la presencia del alelo α, hemos detectado una frecuencia de individuos portadores del alelo α de 0,62 muy similar a la descrita por Soto y cols¹² en población caucásica (0,65).
No se ha detectado una asociación significativa entre las características clinico-biologicas analizadas y la presencia del alelo α determinada por RFLP, si bien se observa una mayor presencia pacientes portadores del alelo α en los controles frente a los pacientes con asma alérgica. Como se ha comentado previamente, se ha comunicado un posible carácter protector del alelo α respecto a las enfermedades alérgicas relacionado con la incapacidad de esta forma para permanecer almacenada con lo que no sería liberada en gran cantidad tras la exposición a antígeno¹³.
Del mismo modo, en nuestra población hemos encontrado un aumento de los niveles de triptasa en el suero de los pacientes portadores del alelo, que podría estar relacionada con una secreción constante de dicha proteína. Es importante tener en cuenta que los niveles de triptasa determinados en suero están condicionados por los epítopos proteicos reconocidos por el sistema InmunoCap. No disponemos de información completa sobre las regiones específicas reconocidas por este método, si bien esta técnica detecta simultáneamente los niveles de triptasa α y β.
En resumen, la triptasa es una de las principales proteasas localizadas en los gránulos de los mastocitos y es liberada en procesos de degranulación debido a lo que se les atribuye un papel importante en procesos inflamatorios y en procesos alérgicos. Se ha descrito que la triptasa posee funciones antagónicas, ya que tiene tanto un importante papel en fenómenos inflamatorios como es un protector contra la infección Se conocen cuatro genes que codifican estas enzimas, en estos genes existen alelos diferentes que dan lugar a tipos de triptasas distintas. Estos genes están siendo estudiados debido a la gran homología existente entre ellos y sus características de genes altamente polimórficos. Debido a esto es importante establecer una relación entre el genotipo y fenotipo en enfermedades como el asma o mutaciones que se supongan de importancia farmacológica. El análisis y caracterización de los pacientes en función de la presencia o no del alelo puede constituir una herramienta para la comprensión y establecimiento de una relación con los niveles de triptasa presentes en suero, así como para establecer las diferencias entre individuos sanos y pacientes con asma de origen alérgico.

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