INTRODUCCIÓN:
La prevalencia de enfermedades alérgicas ha sufrido un notable aumento en los últimos años, en los países occidentales especialmente(1, 2). En Europa, el 20-25% de la población sufre algún tipo de patología alérgica (3). Entre ellas, la que tiene mayor incidencia es la rinitis alérgica, y el alérgeno más ampliamente implicado es el polen de gramíneas. Esta patología tiene un gran impacto en la calidad de vida de los que la sufren, afectando al rendimiento laboral y escolar en muchos casos. Es difícil estimar este detrimento en la calidad de vida, al igual que es difícil valorar la eficacia de su tratamiento (4). Ello se debe, entre otros factores, a la heterogeneidad en la exposición al polen de gramíneas, que puede ser muy variable y dependiente de factores externos como clima o lugar de la exposición, a la deficiente cumplimentación de los diarios de síntomas, a la falta de parámetros o marcadores objetivos para valorar la eficacia del tratamiento y a la subjetividad en la percepción de los síntomas. Por este motivo, los estudios llevados a cabo para valoración de eficacia de tratamiento, inmunoterapia, requieren un gran número de participantes para alcanzar un suficiente significación (5).
La provocación nasal con alérgenos es una técnica ampliamente utilizada tanto en investigación como en el seguimiento clínico de rinitis alérgica (6). Esta técnica puede llevarse a cabo mediante múltiples métodos para aplicar el alérgeno en las fosas nasales como gotas, sprays, filtros impregnados con alérgenos o con exposición continua en cámara de provocación (7, 8). La respuesta clínica tras la provocación puede ser medida por diferentes escalas como la escala total de síntomas nasales (TNSS) (9), escala visual analógica (EVA) (10), pico de flujo inspiratorio nasal (PNIF), rinometría acústica o rinomanometría (11). También existen diferentes métodos para medir la respuesta celular a nivel local en la mucosa nasal como la obtención de fluidos nasales, ya sea con lavados o aplicación de filtros, obtención de células y de material genético mediante cepillado o rascado de la mucosas nasal o mediante biopsia nasal. Sin duda alguna, la biopsia nasal es la prueba gold estándar para la valoración de la respuesta local pero es una prueba invasiva y molesta para el paciente(12, 13).
El objetivo principal de este estudio es el desarrollo y la validación de una metodología para realizar una técnica de provocación nasal con Phleum pratense que sea sencilla, reproducible y aceptada por los pacientes, y que pueda ser utilizada en el diagnóstico y en el seguimiento de la rinoconjuntivitis por hipersensibilidad a gramíneas. Como objetivo secundario, se evaluarán varios métodos de recogida de secreciones nasales tras dicha provocación, con el fin de buscar biomarcadores en fluidos nasales para predecir la respuesta clínica frente a tratamiento inmunoterápico.
MÉTODO
Se trata de un estudio piloto, abierto y unicéntrico en el que participan un total de 20 pacientes con diagnóstico de rinoconjuntivitis alérgica por sensibilización a polen de gramíneas. Los criterios de inclusión fueron los siguientes:

• Adultos de entre 18 a 65 años.
• Historia clínica de más de 2 años de evolución de síntomas de rinoconjuntivitis alérgica moderada-grave durante la estación polínica (Mayo, junio y julio).
• Test cutáneos con pápula mayor de 3 mm a P.pratense.
• Ig E específica mayor de clase 2 para P. Pratense.
• Mujeres que no estuvieran embarazadas antes o durante el estudio.
• Tener capacidad de dar consentimiento informado.
Los criterios de exclusión fueron los siguientes:
• FEV1 menor del 70% del predicho para cada participante.
• Otras sensibilizaciones clínicas relevantes.
• Visitas al hospital por asma bronquial en los 12 meses previos.
• Historia de EPOC u otra patología respiratoria.
• Historia de sinusitis aguda recurrente (2 episodios/año/últimos 2 años).
• Historia de sinusitis crónica (más de12 semanas de evolución).
• Presentar síntomas respiratorios, cuadros infecciosos o requerir tratamiento en la primera visita (screening).
• Fumadores activos o con historia de más de 5 paquetes al año.
• Tratamiento previo con inmunoterapia en los últimos 5 años.
• Anafilaxia o angioedema con necesidad de tratamiento vital.
• Tratamiento inmunosupresor.
• Participación en otros estudios que evalúen medicamentos en los 30 días previos al inicio del estudio.
• La presencia de alguna condición médica que el investigador crea incompatible con el estudio actual.

El estudio consta de 4 visitas separadas entre si 3 semanas y se lleva a cabo fuera del periodo de síntomas.
Antes de acudir al hospital se les informa telefónicamente de que no deben estar tomando medicación, no debiendo haber usado corticoides nasales al menos en los 14 días antes a la prueba, antihistamínicos 5 días o descongestionantes 3 días antes.
En la visita 1 o de screening se obtiene el consentimiento informado del participante, se valoran los criterios de inclusión y exclusión para participar en el estudio y se lleva a cabo un examen físico completo con recogida de signos vitales, realización de test cutáneos con neumoalérgenos habituales y extracción sanguínea para obtención de Ig E específica frente a P. pratense.
A los pacientes que sean incluidos se les realiza a continuación una provocación nasal con dosis crecientes de P.pratense para encontrar la dosis acumulada que es necesaria para alcanzar un TNSS mayor o igual a 5 sobre 12 puntos en la escala.
Antes de comenzar con la provocación y tras la administración de cada dosis se utilizarán las siguientes escalas para valoración clínica:

• Escala de Total de Síntomas Nasales (TNSS).
• Escala Analógica Visual (EVA)
• Pico de Flujo Inspiratorio Nasal (PFIN)

El extracto usado para la provocación nasal es Aquagen SQ de P. Pratense de laboratorios ALK-Abelló. Este se reconstituye previamente a la provocación a una concentración de 100.000 SQ-U/ml, equivalente a 30.000 BU, y se aplica con un dosificador de 200μl que aplica 100μl por pulverización, uno en cada fosa nasal. Las concentraciones que se administran son: 30, 100, 300, 1000, 3000, 10000 BU/ml.
En todas las visitas, a la llegada, el participante tiene un tiempo de aclimatación al entorno hospitalario después del cual se realiza lavado nasal por ambas fosas nasales con suero salino y, posteriormente, se procede a la provocación con alérgeno.
En la visita 2, el procedimiento a la llegada es el mismo pero en este caso se realizará una provocación con dosis acumulada única, y posteriormente se recogerán los datos clínicos a los 5, 15, 30 minutos, 1, 2, 3, 4, 5 y 6 horas tras la provocación. En esta visita se compararán dos matrices sintéticas ultraabsortivas de diferentes laboratorios, cada una de ellas será introducida en una fosa nasal y permanecerán 2 minutos en cada punto de corte para posteriormente retirarlas de las fosas impregnadas de fluidos nasales.
La introducción de las matrices se realiza cuidadosamente bajo visión directa con espéculo y pinzas, y se colocan, a lo largo del cornete inferior, más allá del vestíbulo nasal. Las matrices con las secreciones recogidas en cada punto de corte se introducen en tubos eppendorf con un pequeño filtro de 0,22μm de celulosa para el filtrado de las secreciones mediante centrifugación a 4500rpm y 4º C de temperatura durante 10 minutos. Posteriormente se almacenan a -80º C hasta ser analizadas en el laboratorio.
En las visitas 3 y 4 el procedimiento es el mismo con la diferencia que en la visita 3 se comparará la matriz sintética ultraabsortiva que más secreciones obtuvo en la visita 2 frente a un a esponja de poliuretano en la otra fosa nasal, y en la vista 4 se comparan esponjas en ambas fosas nasales. En estas dos visitas se toma como dosis acumulada para realizar la provocación única la que en la visita 1 obtuvo una TNSS mayor o igual a 7 sobre 12, ya que con la dosis que alcanzaba un TNSS mayor o igual a 5 sobre 12 las secreciones recogidas fueron escasas en algunos de los puntos de corte.
RESULTADOS
Debido a que el estudio está pendiente de publicación actualmente no podemos mostrar aquí con detalle los resultados obtenidos en el mismo.
En el estudio participaron 20 pacientes con rinitis alérgica por hipersensibilidad a polen de gramíneas, de ellos, sólo 18 completaron las 4 visitas.
RESULTADOS CLÍNICOS:
Durante la visita 1 se llevó a cabo la curva dosis-respuesta con dosis creciente de gramíneas. Trece de los participantes toleraron la realización de la curva completa hasta la dosis de 10.000 BU/ml, uno toleró una dosis máxima de 1.000 BU/ml u cuatro alcanzaron dosis máximas de 3.000 BU/ml. La dosis moda para alcanzar un TNSS mayor o igual a 5 sobre 12 fue 1.000 BU/ml y para un TNSS de 7 sobre 12 fue 3.000 BU/ml. Fueron necesarias dosis de 1.000 BU/ml para producir una caída significante del PFIN y dosis de 300 BU/ml para producir un incremento en la EVA respecto al estado basal. Durante las visitas 2 a 4 el TNSS alcanzó el pico máximo a los 5 minutos tras la provocación, mientras que el PFIN alcanzó su mínimo a los 30 minutos. Tanto en las visitas 3 como 4 los picos alcanzados de TNSS tras la provocación fueron mayores que en la visita 2. La escala visual analógica mostraba valores máximos a los 15 minutos de la provocación. Ninguno de estos tres parámetros mostraban diferencias significativas entre las visitas 3 y 4.
RESULTADOS INMUNOLÓGICOS:
En las secreciones nasales obtenidas tras cada provocación se realizaron mediciones de diferentes biomarcadores. Para ello, se llevaron a cabo técnicas de ELISA y citometría de flujo. Como marcadores de actividad de linfocitos T colaboradores tipo 2 (Th2) se midieron IL-4, IL-5 e IL- 13, interferón-γ (INF-γ) como marcador de actividad de linfocitos T colaboradores tipo 1 (Th1), triptasa, proteína catiónica del eosinófilo (ECP) e IL-10 como citocina reguladora.
En la visita 2 sólo se obtuvo fluido nasal suficiente para realizar las mediciones de laboratorio en 6 pacientes por lo que los resultados son muy limitados.
En las visitas 3 y 4 los patrones de incremento de los biomarcadores seleccionados fueron muy similares, con aumento de niveles de triptasa a su máximo a los 5 minutos tras la provocación y vuelta a la normalidad tras 2 horas. Los niveles de ECP alcanzaron su máximo a las 5 horas tras la provocación con posterior disminución de los síntomas, al igual que las interleucinas IL-4, IL-5 e IL-13, y también IL-10. Los niveles de INF-γ no siguieron ningún patrón determinado en las diferentes visitas, con un ligero aumento en las fases tardías tras a provocación pero sin significación clínica.
Las matrices que obtuvieron en todos los casos mayor volumen de fluidos nasales fueron las esponjas de poliuretano.
DISCUSIÓN
En este estudio piloto se demuestra que la provocación nasal con gramíneas puede ser una técnica reproductible y cuyos resultados pueden evaluarse mediante métodos sencillos de escalas como TNSS y EVA y con PFIN.
Mediante la obtención de fluidos nasales se pueden medir una variedad de biomarcadores, con resultados también reproducibles tanto para la fase aguda como tardía tras la provocación.
Debido a la dificultad para evaluar clínicamente la rinitis alérgica estacional y para evaluar la eficacia de su tratamiento, como la eficacia de la inmunoterapia, la realización de provocación nasal con alérgenos puede ser usado como marcador clínico. A su vez, esta técnica añade el beneficio de poder estudiar los mecanismos de inflamación alérgica que ocurren a nivel de la mucosas nasal.
Para la medición de resultados clínicos tras la provocación hemos utilizados escalas validadas, que aunque pueden ser subjetivas, ambas guardan muy buena correlación entre si, y a su vez buena relación inversa con los valores de PFIN.
Se podría pensar que debido a la inserción de la matriz en la fosa mecánica podríamos producir una inflamación y una respuesta por efecto mecánico o irritativo pero los resultados obtenidos en los síntomas o en los biomarcadores nos marcan una respuesta alérgica y no irritativa.
Previamente al estudio se llevó a cabo el mismo procedimiento realizando la provocación con suero salino para tener un control con placebo, en el que no se evidenciaban cambios inflamatorios a nivel de la mucosa nasal.
Por tanto, esta técnica de provocación nasal además de ser utilizada para investigación puede ser muy útil en la práctica clínica para el estudio de nuevos biomarcadores en la inflación mucosa de la rinitis alérgica y para valorar la eficacia del tratamiento mediante un proceso sencillo, reproducible y bien tolerado por el paciente.

BIBLIOGRAFÍA

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Anexo

Escala Total de Síntomas Nasales (TNSS): Modificada de Bousquet et al 1978 y Lent et al 2006.

- Pico Flujo Inspiratorio Nasal(PFIN)

- Escala Visual Analógica (EVA): 1-100mm. (Kim YH et al)