En las últimas décadas estamos asistiendo, por una parte a la identificación, aislamiento y purificación de gran número de alérgenos de diverso origen y, por otra, a la aplicación de la tecnología DNA recombinante al campo de la Alergología para la producción biotecnológica de alérgenos de elevada pureza y calidad consistente lote a lote, de forma que el uso de alérgenos purificados, naturales o recombinantes, supone un avance real en la Alergología clínica [1].

La combinación de estos avances de la biología molecular con los producidos en la nanotecnología ha permitido el desarrollo de nuevas tecnologías, entre las que se encuentran las denominadas micromatrices o microarrays. El microarray de proteínas permite la detección de IgE específica frente a múltiples moléculas de forma simultanea, posibilitando el denominado diagnóstico molecular o diagnóstico por componentes (component-resolved diagnosis CRD), que tiene un interés especial en el diagnóstico de alergia alimentaria así como en el diagnóstico de precisión de pacientes polisensibilizados [2].

El primer ensayo experimental de micromatrices aplicado a alergia fue publicado en el año 2000 [3]. En sus comienzos esta técnica se realizaba con un número limitado de alérgenos procedentes de fuentes alergénicas completas [3-5].

En el año 2002 y 2003 se publican los primeros resultados de esta tecnología utilizando proteínas extraídas de 35 fuentes alergénicas distintas [6,7].

Posteriormente se han desarrollado soportes con un número creciente de moléculas recombinantes y purificadas fijadas, siendo el prototipo ISAC comercializado por Phadia, el primer microarray de proteínas aplicado a la detección de IgE específica , que en su versión actual (Enero 2011) esta compuesto por 103 components (ImmunoCAP ISAC-CRD 103, Thermofisher, Uppsala, Sweden).

La técnica nace con unas interesantes espectativas ya que teóricamente va a conseguir la miniaturización del diagnóstico alergológico y hacer realidad el sueño de conocer todas las especificidades de la IgE que presenta un paciente alérgico [8], permitiendo al clínico acceder a una información refinada, sobre los perfiles de sensibilización que presenta un paciente, predecir en ocasiones la gravedad de las reacciones, la evolución de las mismas y la indicación precisa de inmunoterapia en el caso de alergia respiratoria (9).

Diagnóstico molecular o Component resolved diagnosis (CRD)

El término Component resolved diagnosis (CRD) acuñado por el grupo de Valenta al final de los años noventa [1] abre una nueva etapa en el concepto diagnóstico e inmunopatológico de la alergia.

El uso de un panel adecuado de alérgenos purificados, naturales o recombinantes, permite mejorar las técnicas diagnósticas tradicionales de detección de IgE específica basadas en el uso de extractos completos en cuanto a reproducibilidad y estabilidad, especialmente en el caso de los alimentos vegetales con bajo contenido proteíco, y que poseen actividad enzimática que degrada los alérgenos [10,11].

El CRD nos va a permitir identificar los patrones individuales de sensibilización frente a diferentes proteínas de una misma fuente alergénica, con la posibilidad de identificar:

• Patrones de sensibilización según área geográfica [12,13].

• La sensibilización a proteinas asociadas a un mayor riesgo de reacciones graves, como las proteinas trasportadoras de lípidos (“lipid transfer proteins”: LTP) [13,14].

• Sensibilización a proteínas homólogas en diferentes fuentes alergénicas con posible implicacion en fenómenos de reactividad cruzada [15,17].

• Indicar de forma precisa una inmunoterapia.

Ag relevantes-Reactividad Cruzada

La presencia de IgE específica frente a una fuente alergénica no siempre es clínicamente relevante en alergia. Una de las causas frecuentes de estos falsos positivos es la existencia de reactividad cruzada entre componentes alergénicos homólogos presentes en distintas fuentes alergénicas, en ocasiones no relacionadas taxonómicamente.

La reactividad cruzada entre estructuras moleculares cercanas presentes en alimentos y aeroalérgenos da lugar a fenómenos clínicos o síndromes tales como el síndrome apioespecias- zanahoria-artemisia, el síndrome latex-frutas, cuya base molecular son las quitinasas, la reactividad cruzada abedul-rosaceas por PR-10 o gramíneas-rosáceas con la profilina como responsable, el síndrome ácaros-gamba-cucaracha en el que estaría implicada la tropomiosina; el síndrome ave-huevo por sensibilización a livetinas, el síndrome cerdo-gato y otros cuadros de reactividad cruzada entre carnes y epitelios con la implicación de la albúmina sérica, etc. Por otra parte la sensibilización frente a alérgenos de familias filogenéticamente conservadas como las proteínas de almacenamiento (albúminas 2S, globulinas 7S y 11S) o LTP son causas de reactividad cruzada inmunológica entre alimentos (frutos secos, leguminosas y/o semillas en el caso de las proteínas de almacenamiento; rosáceas, otras frutas, hortalizas y vegetales en general en el de LTP) con variable repercusión clínica. En todo caso, el conocimiento del perfil de sensibilización individual de un paciente permite analizar los potenciales síndromes de reactividad cruzada [1], lo cual permitirá explorar su tolerancia y/o realizar recomendaciones preventivas.

Riesgo de reacciones graves en la alergia alimentaria

Existe un importante cuerpo de evidencia respecto a la asociación entre determinadas manifestaciones clínicas y ciertos patrones de reconocimiento [13,18] de forma que la sensibilización a distintos componentes alergénicos de una misma fuente lleva a distintas formas de reaccionar. Un buen ejemplo de ello lo constituyen los diferentes patrones de reconocimiento de componentes del trigo [19] de pacientes con asma de los panaderos, alergia alimentaria a trigo, alergia a su polen y anafilaxia inducida por ejercicio dependiente de la ingestión de cereales. Por otra parte, la sensibilización a proteínas lábiles como las homólogas de Bet v 1 y a profilinas se relacionan con clínica local relacionada con la ingestión de vegetales crudos, mientras que la sensibilización a alérgenos más estables a procesos fisico-químicos como las LTP, quitinasas, vicilinas, albúminas 2S, leguminas y 5- ω-gliadina comportan mayores probabilidades de reacción sistémica incluso tras la ingestión de alimentos procesados.

Evaluación del paciente polisensibilizado e indicación precisa de Inmunoterapia

Un reto diagnóstico importante para el clínico es el que surge al analizar los resultados de las pruebas cutáneas y determinacion de IgE específica frente a extractos de fuentes alergénicas completas en un paciente polínico polisensibilizado, con y sin alergia alimentaria.

Por otra parte la indicación correcta y precisa de una inmunoterapia Antígeno-específica puede constituir un problema para el clínico, que con la ayuda del diagnóstico por componentes puede verse facilitado.

El diagnóstico por componentes puede modificar el diagnóstico convencional y las indicaciones terapéuticas hasta en un 50% de los casos (20)

Estudios de validación de la tecnología los microarrays mediante tecnología propia o comercializada (ISAC) en alergia

Esta tecnología se ha comparado con los métodos convencionales de detección de IgE observando una adecuada correlación [4,7,21-24], aunque para algunos alérgenos la sensibilidad de la técnica del microarray podría ser menor [24] por la ausencia de modificaciones glucídicas de las proteínas producidas en sistemas bacterianos que juegan un papel importante en la unión con la IgE [25] o por estar incompleto el panel de los componentes alergénicos posibles de la sensibilización a una fuente alergénica.

Estudios de validación clínica de la técnica ISAC en alergia a inhalantes realizados por Jahn-Schmid y cols ( 26 ) encuentran una buena concordancia de esta técnica con el InmunoCAP convencional y una especificidad y sensibilidad analítica similar.

Así mismo se ha podido comprobar como la capacidad diagnóstica del ISAC CRD103 y CAP frente a extracto completo en alergia a gramíneas y ciprés son idénticas con excelente concordancia y como esta nueva tecnología presenta capacidad para diferenciar entre una sensibilización genuina a alérgenos mayoritarios de los pólenes de una sensibilización a panalérgenos que darían falsos positivos mediante PC o CAP (25).

En alergia alimentaria Ott y cols [28] analizan 130 niños con sospecha de alergia alimentaria mediada por IgE, con Prueba de Provocación con leche de vaca y/o huevo, prueba cutánea (PC) y IgE específica. Aplican un Microarray (ISAC CRD-51, VBC Genomics) que incluye Ovomucoide, Ovoalbúmina, Lysozyma, α-lactoalbumina, β-lactoglobulina y Caseínas. Aplicando curvas ROC, los valores de área bajo la curva (AUC) de PC, CAP y Microarray fueron similares para componentes de leche y huevo, excepto lisozima cuya AUC fue inferior, a la del extracto completo.

Los valores predictivos positivos de ISAC CRD-51 fueron del 78% para leche y del 100% para el huevo, analizando en conjunto todos los componentes. Estos autores concluyen que los componentes de leche y huevo de este microarrays ofrecen resultados equivalentes a los encontrados con PC y/o IgE específica, sin que ningún componente exclusivo discrimine entre una sensibilización irrelevante y una genuina.

Por otra parte Gaudin et al [23] utilizando un microarray propio analizan las proteínas implicadas con mas frecuencia en niños alérgicos a leche, identifica perfiles de reconocimiento diferentes entre alérgicos y no alérgicos y encuentran que la Lactoferrina bovina es un Ag mayoritario en alergia a leche.

Se ha observado que en niños con sospecha de alergia a leche y/o huevo el ISAC CRD- 89 (Phadia) es capaz de predecir una prueba de provocacion positiva y podría ser utilizado como prueba de segundo nivel, reduciendo la indicación de pruebas de provocación en el diagnóstico de esta patología [29].

Se han identificado epítopes diferenciales en casos de anafilaxia inducida por ejercicio [30] Battais et al identifican ciertos epítopes de unión a la IgE en la gliadina relacionados con la presencia de alergia alimentaria a harina de trigo [31] .

Diferentes estudios realizados en pacientes alérgicos a cacahuete [32,33] han demostrado como la sensibilización frente a algunos epítopes, determinada mediante microarrays estaría relacionada con la severidad del cuadro clínico. Los pacientes con historia de reacciones multisistémicas más graves reconocen un mayor número de epítopos de Ara h 1, Ara h 2 y Ara h 3 y hay correlacion entre la diversidad de epítopos Arah1, Ara h 2, Ara h 3 reconocidos por la IgE de un paciente y la gravedad del cuadro clínico [34]. Por otra parte Flinterman et al [34] no encontraron ningún grupo de péptidos que se asocie a gravedad. Parecen existir diferencias en el patrón de sensibilización de niños alérgicos y los tolerantes a cacahuete, siendo el componente Ara h 2 el más importante para predecir alergia clínica a cacahuete [35].

Existen además diferencias geográficas, los resultados indican que Ara h 9 (LTP) parece jugar un importante papel en la alergia a cacahuete del área mediterranea [36].

Por otra parte Act d 1 puede ser considerado como marcador de sensibilización genuina a kiwi y el diagnostico molecular puede mejorar el valor pronóstico del diagnóstico in vitro [37].

Referente a la asociación de alergia a latex y alimentos, Radauer et al [38] estudian 16,408 sueros de pacientes alérgicos y su union por IgE a la heveina, y a otros componentes del látex detectando un 58% de los casos de positividad frente a Heveina.

Verweij et al [39] en un estudio realizado en niños con dermatitis atopica menores de 1 año y mediante microarrays ISAC de 103 componentes observan como la mayoría de los pacientes presentan sensibilización a la LTP Cor a 9.

Conclusiones

La tecnología de los microarrays constituye un avance importante en el diagnóstico de la alergia, nos permite establecer un diagnóstico molecular preciso, conocer los patrones de sensibilización que presenta un paciente con las diferencias propias según el área geográfica a la que pertenece y detectar sensibilización a moléculas responsables de síndromes de reactividad cruzada. Una clara indicación de esta herramienta es en el estudio del paciente polisensibilizado y en la indicación precisa de una inmunoterapia.

Se requieren estudios de validación, dado que en ocasiones algunos estudios adolecen de la falta de información adecuada que ayude a interpretar la relevancia de las sensibilizaciones detectadas por la técnica [50]. En este sentido son necesarios ensayos con poder estadístico suficiente para validar esta tecnología [16].

Por otra parte y tal y como apuntan Salcedo y Diaz-Perales [13] existen algunas limitaciones en la técnica, tales como la composición del panel de alérgenos, que puede no ser el más adecuado para algunas áreas geográficas. Por otra parte la evaluación de la sensibilidad, especificidad y puntos de corte para cada alérgeno, en series de pacientes verdaderamente alérgicos y en controles para cada proteína representada en el microarray, constituye una necesidad real para poder situar a esta prometedora herramienta en su justo lugar en el diagnóstico alergológico en general y en el de la alergia alimentaria en particular. No debemos olvidar que todos los test in vitro deben ser evaluados junto con la historia clínica del paciente, ya que una sensibilización (detectada in vitro por la presencia de anticuerpos IgE específicos) no implica necesariamente una respuesta clínica frente a dichos alérgenos.

Bibilografía

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